田鈺琪，王鳳林，陳斌，崔小冬，段玉龍，賡迪，王晶，孫藝茹，王春梅※

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物制藥系，北京 100029；2.武警總醫(yī)院藥劑科，北京 100039）

暹羅鱷（Crocodylus siamensis）是鱷科（Crocodylidae）鱷屬（Crocodylus）的一種中型鱷魚，是我國人工養(yǎng)殖較為廣泛的種類，成年個體體長2m～3m，體重40kg～70kg。鱷魚生活環(huán)境較為惡劣，充斥各種病原體，其食譜冗雜，捕食之外亦會取食動物尸體，但野生鱷魚鮮少發(fā)現(xiàn)感染細(xì)菌、病毒[1]，這一特性與其強(qiáng)大的免疫系統(tǒng)密切相關(guān)。鱷魚的免疫系統(tǒng)和抗逆境能力得到了研究者的廣泛關(guān)注，對鱷魚中生物活性物質(zhì)及其藥理作用亦有所闡述[2]。針對鱷魚血的研究也獲得了許多成果，鱷魚血被認(rèn)為有良好的抗菌[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5]效果。當(dāng)下人工養(yǎng)殖鱷魚資源豐富[6]，但綜合利用度不夠，多用于皮革工業(yè)及保健功能食品開發(fā)[7]。對于人工養(yǎng)殖的鱷魚血抗病毒作用的研究目前未見報道。本研究選取人類易感且流行性較強(qiáng)的甲型流感病毒、單純皰疹病毒及乙肝病毒進(jìn)行抗病毒相關(guān)體外研究，為后續(xù)深入研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料、儀器與試劑

人工養(yǎng)殖暹羅鱷來源于海南三亞龍虎園養(yǎng)殖場，由北京洪源澳達(dá)投資有限公司提供。

狗腎細(xì)胞（MDCK）、非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心）；HBV病毒DNA轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞株（HepG22.2.15，ATCC）、甲型流感病毒（濟(jì)防90-15）（中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所）；單純皰疹病毒（HSV-IVR733，ATCC）、雞胚（北京梅利亞維通實驗動物技術(shù)有限公司）。

病毒唑、無環(huán)鳥苷（ACV）（湖北科益制藥廠）；拉米夫定（Lamivdine，LAM，100mg/片，葛蘭素史克制藥有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（GIBCOBRL公司）；胎牛血清（HyClone公司）；雙抗、胰酶、DMSO、ELISA試劑盒（北京萬泰生物藥品公司）

低溫冰箱（REVCO公司）；低溫高速離心機(jī)（賽默飛公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（SANYO公司）；超凈工作臺（哈爾濱市東聯(lián)公司）；移液器（Eppendorf公司）；倒置熒光顯微鏡（Nikon公司）；酶標(biāo)儀（美國分子儀器公司）。

2 方法

2.1 血清、血漿及白細(xì)胞提取物樣品制備

鱷魚頸部竇靜脈取全血，加入1/10體積抗凝劑（3.8%枸櫞酸鈉溶液），3 000r/min離心10min，取上清為血漿；中層少量為白細(xì)胞，白細(xì)胞層進(jìn)一步用低滲法除去紅細(xì)胞后離心，再反復(fù)凍融破碎白細(xì)胞后為白細(xì)胞提取液。取全血，4℃冰箱靜置至分層，上層即為血清。

得到的血漿、血清和白細(xì)胞提取物過濾除菌，4℃冰箱保存待用。

2.2 病毒培養(yǎng)

將病毒接種于10日齡雞胚的尿囊中，每個雞胚接種 0.2mL，35°C 培養(yǎng)72h后，置于 4°C 放置6h，取尿囊液，備用。

2.3 病毒半數(shù)組織細(xì)胞感染量（TCID50）測定

使用 DMEM 培養(yǎng)基梯度稀釋含病毒雞胚尿囊液，稀釋梯度為102～107，96孔板中加入100L胰酶消化的細(xì)胞（濃度2×105cell/mL）及100L稀釋病毒培養(yǎng)液。37°C，5%CO2培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)病毒細(xì)胞病變（CPE）達(dá)到++++時，觀察并記錄結(jié)果。采用Reed&Muench方法[8]計算TCID50值。

2.4 樣品對各細(xì)胞株細(xì)胞毒性測定

用MTT方法測定不同稀釋濃度血清對細(xì)胞的抑制情況，計算血清、血漿、白細(xì)胞提取物對MDCK、Vero細(xì)胞株的TC50及對HepG22.2.15的TC50

2.5 抗甲型流感病毒活性及抗單純皰疹病毒活性實驗

胰酶消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，稀釋濃度至2×105cell/mL，取100L接種96孔培養(yǎng)板，5%CO2、37°C培養(yǎng)24h后加入病毒稀釋液，至終濃度為100倍TCID50。37℃吸附2h后傾去病毒液，再分別加入不同稀釋度樣品及相應(yīng)陽性藥物，同時設(shè)病毒對照組和細(xì)胞對照組。37°C培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果，記錄CPE，計算各樣品抗甲型流感病毒半數(shù)抑制濃度，并比較選擇指數(shù)（SI）值。

2.6 抗乙肝病毒活性實驗

HepG22.2.15細(xì)胞100L（5×104cell/mL）接種 96孔板，培養(yǎng)24h后棄上清，加入不同濃度的樣品、陽性藥及陰性對照培養(yǎng)基。每個樣品分為5個濃度（稀釋102～106倍），每個濃度重復(fù)3個復(fù)孔，3d更換培養(yǎng)液1次，共換3次，培養(yǎng)9d后收集細(xì)胞上清液，ELISA檢測HBV病毒學(xué)指標(biāo)。

2.7 有效性判斷

通過計算SI值考察樣品有效性，SI=TC50/IC50。SI＜1，藥物無效；1＜SI＜2，藥物低效有毒；SI＞2，藥物有效，SI數(shù)值越高，藥物安全范圍越大。

3 結(jié)果

3.1 暹羅鱷血抗甲型流感病毒活性

以雞胚尿囊膜液為病毒原液，進(jìn)行倍比稀釋后測得甲型流感病毒的TCID50值為106倍稀釋濃度。經(jīng)過MTT實驗，測得人工養(yǎng)殖暹羅鱷血漿、血清及白細(xì)胞提取物對 MDCK細(xì)胞的 TC50分為原液的10%、4.76%及4.76%，故考察樣品稀釋倍數(shù)為102～106濃度對甲型流感病毒的作用。鱷魚血漿及血清抗甲流病毒SI值為46.33和55.62，表明血漿及血清具有較好的體外抗甲型流感病毒的作用；白細(xì)胞提取物在TC50濃度以下未觀察到抑制細(xì)胞病變的作用，較高濃度即產(chǎn)生細(xì)胞毒性，表明白細(xì)胞提取物對甲型流感病毒無抑制作用。結(jié)果見表1。

表1 暹羅鱷血漿、血清、白細(xì)胞提取物對甲型流感病毒作用Tab.1 Effect of plasma，serum，and leukocyte extracts from Siamese crocodile on influenza A virus

3.2 暹羅鱷血抗單純皰疹病毒活性

單純皰疹病毒對Vero細(xì)胞的TCID50為105倍病毒原液。本實驗結(jié)果表明，鱷魚血清、血漿、白細(xì)胞提取物在＞100倍稀釋時對Vero細(xì)胞產(chǎn)生毒性，否則，均對單純皰疹病毒無抑制作用。

表2 暹羅鱷血漿、血清、白細(xì)胞提取物對單純皰疹病毒作用情況Tab.2 Effect of plasma，serum，and leukocyte extracts from Siamese crocodile on Herpes simplex virus

3.3 暹羅鱷血抗乙肝病毒活性

暹羅鱷血清、血漿和白細(xì)胞提取物稀釋100倍后作用于hepG22.2.15細(xì)胞，不產(chǎn)生細(xì)胞毒性，半數(shù)毒性濃度（TC50）為原樣品的10%。使用拉米夫定50g/mL 作為陽性對照藥，ELISA測定作用后乙肝病毒表面抗體抗原HBsAg及乙肝e抗原HBeAg的量，并計算得到的IC50。結(jié)果見表3。

表3 暹羅鱷血漿、血清、白細(xì)胞提取物對乙肝病毒抗原分泌作用情況Tab.3 Effect of plasma，serum，and leukocyte extracts from Siamese crocodile on antibody exudatiton of Hepatitis B Virus

實驗表明，暹羅鱷血清及血漿對乙肝病毒HBsAg及HBeAg的分泌均有抑制作用，白細(xì)胞提取物在很低濃度對乙肝病毒HBsAg的分泌有抑制作用明顯，但對乙肝病毒HBeAg的分泌無抑制作用。

4 討論

人工養(yǎng)殖鱷魚技術(shù)成熟，資源豐富。暹羅鱷在我國已經(jīng)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖[9，10]。2013年，鱷魚血薄膜衣片保健食品已經(jīng)上市，相關(guān)的藥效研究也有利于鱷魚資源的開發(fā)[11]。鱷魚的抗菌[12]、抗腫瘤[13]、抗病毒研究是研究者關(guān)注的主要方向。Merchant研究證明，野生美洲鱷血清及白細(xì)胞提取物對HIV病毒[14]、HSV-1病毒均有一定抑制作用。

本研究表明，人工養(yǎng)殖鱷魚血液有一定體外抗甲型流感病毒及乙肝病毒活性，由本實驗結(jié)果推斷，暹羅鱷魚血清、血漿中應(yīng)含有某些抗病毒活性物質(zhì)，本實驗結(jié)果為后續(xù)深入進(jìn)行鱷魚血抗病毒研究提供基礎(chǔ)。

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