夏體淵，陳澤斌，蘇 源，劉佳妮，余 磊，王定康，徐勝光

(1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.云南省高校特色生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，云南 昆明 650214；3.云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650214；4.云南省高校生物炭工程研究中心，云南 昆明 650214)

【研究意義】煙草是中國重要的經(jīng)濟作物，它在國民經(jīng)濟中占有重要的地位。中國人口越來越多，田地越來越少，煙草輪作的條件越來越受到限制[1]，煙草每年連作引起的經(jīng)濟損失每年高達40億元[2]。連作影響根際土壤有益生物的生存，進而影響有機營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和傳遞，同時增加了一些致病微生物的富集，一系列連鎖反應(yīng)嚴重影響了煙葉的品質(zhì)和產(chǎn)量，加重了煙草作物的各種病害的發(fā)生。所以探明連作障礙的原因并采取有效措施減緩連作障礙已成為目前的研究熱點。作物根際土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的組成部分，它是土壤生態(tài)系統(tǒng)中能量流、物質(zhì)循環(huán)和信息傳遞的主要參與者，因此從根際微生態(tài)系統(tǒng)的角度研究障礙具有重要的理論和實踐意義[3]?！厩叭搜芯窟M展】目前關(guān)于連作對作物根際土壤微生物影響的研究已有報道，黃瓜連作后，有益微生物受到限制，有害生物得以迅速繁殖，導(dǎo)致病害加重[4]。岳冰冰等利用BiologTM微平板檢測技術(shù)研究表明，烤煙連作明顯降低了土壤微生物碳源的利用率，削弱了微生物群落的代謝活性[5]。目前已有研究表明通過不同作物間的輪套作來改善植物根際微環(huán)境，在一定程度上可以減輕作物病害。馮俊喜等研究表明煙草—小麥套作體系下微生物群落指數(shù)增大[6]，煙草—小麥套作能減低烤煙馬鈴薯Y病毒的發(fā)病率，與甘薯套種能有效減輕煙草病毒病的危害[7]。煙草與大豆套作能提高煙田根際微生物的多樣性，增加有益菌群的數(shù)量，減輕土傳病害的發(fā)生程度[8]。煙蒜套作較單作烤煙根際土壤速效養(yǎng)分供應(yīng)能力較強，特別是對磷活化利用，能提高煙葉產(chǎn)量[9-10]人們已通過研究利用合理的套作體系對控制連作障礙也有了一定成效，賈蘭虹等[11]研究表明通過萬壽菊與圓蔥套作能使萬壽菊和圓蔥的病菌侵染都得到遏制，有效提高各自產(chǎn)值；魏環(huán)宇等[12]通過萬壽菊與當(dāng)歸的套作研究表明萬壽菊可顯著影響根際土壤中真菌的種類及群落結(jié)構(gòu)組成。孫建波[13]等采用Real-time PCR和T-RFLP技術(shù)對巴西蕉不同生長期根際細菌數(shù)量和多樣性的研究表明，隨著生長期的增加，細菌數(shù)量呈現(xiàn)先增加后減少，而細菌多樣性呈逐漸減少趨勢?！狙芯壳腥朦c】但迄今為止關(guān)于萬壽菊—煙草套作體系中煙草不同生長期根際土壤微生物種類變化的研究尚未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究采用近年來興起的Illumina MiSeq第二代測序技術(shù)全面而準確地對萬壽菊—煙草套作體系下不同生長時期根際土壤微生物種類組成進行研究，相比變性凝膠梯度電泳和構(gòu)建克隆文庫技術(shù)，無需構(gòu)建克隆；且通量高，可對混合物直接進行測序，節(jié)約了98 %以上的時間。本研究旨在探明萬壽菊—煙草套作體系下根際土壤微生物群落變化情況，從根際微生態(tài)系統(tǒng)的角度探明煙草—萬壽菊套作體系的防病機理，為今后萬壽菊與其他作物的套作應(yīng)用提供理論依據(jù)。

表1 樣品編號

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草為云煙87，2016年4月22-24日移栽于宣威市落水鎮(zhèn)試驗田，每棵煙苗旁播種3顆萬壽菊種子，以單作煙草為對照。采用5點取樣法于2016年5月中旬至9月分別采集團棵期、旺長期、現(xiàn)蕾期、成熟期4個時期煙草單作、萬壽菊-煙草套作體系煙草根際土壤，樣品編號見表1，采集后立即放入保鮮袋中，24 h內(nèi)進行土壤DNA提取。

1.2 總DNA提取

參照Omega公司的D5625-01 Soil DNA Kit土壤基因組DNA提取試劑盒的步驟提取各根際土壤樣品DNA，用0.8 %的瓊脂糖凝膠電泳檢查后，用無菌水稀釋至1 ng/μl。

1.3 ITS2區(qū)及16S rDNA-V4區(qū)的PCR擴增

使用帶標簽序列(Barcode)的ITS2區(qū)及16S rDNA-V4區(qū)特異引物3F/4R及515F/806R，使用KOD-Plus-Neo高保真PCR酶進行PCR，用2.0 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送北京諾禾致源生物信息科技有限公司，進行MiSeq測序。

1.4 下機數(shù)據(jù)的質(zhì)控及分析

剔除標簽序列(Barcode)和引物序列，F(xiàn)lash軟件[14]進行序列拼接，并通過qiime軟件[15]過濾得到的序列與Golddatabase數(shù)據(jù)庫中的已知序列比對，在用UCHIME軟件[16]去除嵌合體序列，得到有效序列。用Uparse軟件[17]在97 %的相似性水平上劃分操作分類單元，代表序列的注釋采用RDP分類軟件[18]和GreenGene數(shù)據(jù)庫[19]完成，利用Mothur軟件作稀釋度曲線，計算文庫覆蓋率(Coverage)，Chao1指數(shù)及Shannon指數(shù)計算方法參見文獻[14]。使用R語言畫樣品OTU分析維恩圖，通過Canoco軟件作PCA主成分分析顯示樣品間的差異，利用Fastunifrac軟件分析得到樣品間距離矩陣，繪制基于Weighted Unifrac距離的UPGMA聚類樹。

表2 樣品中細菌OTU豐度和α多樣性指數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果與有效性驗證

8個樣品的細菌16S rRNA基因V4區(qū)序列被測序，得到281 109條原始序列，部分低質(zhì)量序列被過濾，最終得到有效序列為260 578條。在97 %的相似度下，總共產(chǎn)生了14 360個OTU，各樣品測序結(jié)果如表2所示。在煙草4個生育期中OTU數(shù)量呈先下降后又升高，最終在成熟期又下降的趨勢，在現(xiàn)蕾期達到峰值。單作與套作在4個時期相應(yīng)文庫覆蓋率在93.9 % ～ 96.6 %，所有樣品的稀釋曲線趨于光滑(圖1)，表明這些序列基本上反映了真實環(huán)境中的細菌群落結(jié)構(gòu)，但稀釋曲線仍不飽和，有些微生物種類尚未檢出。

通過8個樣品基因組DNA中ITS1的基因測序，得到309 552條原始序列，部分低質(zhì)量序列被過濾，最終得到有效序列為189 716條。在97 %的相似度下，總共產(chǎn)生了3288個OTU，各樣品測序結(jié)果如表3所示。由圖2可以清晰看出，所有樣品的稀釋曲線趨于光滑，表明這些序列基本上反映了真實環(huán)境中的真菌群落結(jié)構(gòu)，但稀釋曲線仍不飽和，有些微生物種類尚未檢出。

由表3中的Alpha多樣性指標中覆蓋度率可知，各樣品文庫覆蓋率在99.2 %～99.7 %，已大致代表了該序列中的所有真菌群落結(jié)構(gòu)。從土樣中的香農(nóng)指數(shù)可以看出，套作體系下的香濃指數(shù)大部分高于單作中的香農(nóng)指數(shù)，表明套作提高了土壤中生物群落差異性。同時套作中的Chao1指數(shù)也普遍大于單作，進一步說明萬壽菊與煙草套作提高了根際土壤微生物群落的總體豐度。

2.2 各樣品間微生物群落相關(guān)性分析

以個樣品得到的OTUs數(shù)目為依據(jù)，對各樣品間微生物群落相關(guān)性狀進行分析，并構(gòu)建細菌群落花瓣圖。根據(jù)圖3可知，單作與套作在4個不同生育期的8組樣品中，有752個OTUs均在8個樣品中出現(xiàn)。無論是在單作還是套作體系下，在現(xiàn)蕾期OTUs值均達到最高為140和147。隨著植物的生長在不同時期有不一樣的OTUs數(shù)目，存在一定的差異，但也存在一定的規(guī)律，總的來說單作煙草變化幅度比較大，套作的OTUs變化相對穩(wěn)定。

圖1 細菌豐度稀釋度曲線Fig.1 Rarefaction curves for bacterial

圖2 細菌豐度稀釋度曲線Fig.2 Rarefaction curves for fungus

樣品名Sample name原始序列數(shù)Raw number質(zhì)控序列數(shù)Clean number有效序列數(shù)Effective numberOTU數(shù)量(97 %)OTUs α多樣性Alpha diversity香農(nóng)指數(shù)(97 %)Shannon Chao1指數(shù)(97 %)Chao1覆蓋率(%)CoverageA1.137 91525 50524 3824235.502482.15999.4BB1.127 13018 32017 7523455.346357.07399.7A2.236 17022 53521 3654255.648467.01299.5BB2.245 58531 03529 9874635.727598.04399.2AB3.230 77721 00020 1613445.547405.62099.6BB3.244 95832 12831 2993895.411508.09599.3AB4.142 96225 89124 9624495.902489.86799.5BB4.144 05520 59419 8084505.965505.07999.5

同樣以序列真菌測定中所得的OTUs數(shù)目為依據(jù)，進行各樣品間真菌群落相關(guān)性狀分析，構(gòu)建花瓣圖。由圖4可知，各樣品共有的OTUs數(shù)目為162，同時無論是單作還是套作每個時期的OTUs數(shù)目都大大低于細菌的，說明植物根際微生物群落中細菌是主要優(yōu)勢菌種。不同栽培方式在不同時期表現(xiàn)不一樣的OTUs，單作中在成熟期OTUs數(shù)目達到峰值24，現(xiàn)蕾期時最小為7，套作體系下成熟期達到峰值21，團棵期最小為6。進一步說明套作改變了不同時期真菌群落多樣性分布。

2.3 單作與套作模式煙草土壤微生物多樣性的PCA分析

從圖5可知，主成分1(PC1)可解釋全部土壤樣品細菌群落多樣性的18.27 %，主成分2(PC2)可解釋土壤樣品細菌群落的16.04 %，兩者總計可解釋全部土壤樣品的34.31 %。圖5表明單作烤煙與萬壽菊和烤煙套作兩處理在不同時期有不同的細菌群落結(jié)構(gòu)，存在明顯的差異；樣品A1.1與BB1.1均分布在PC1和PC2的正值區(qū)域，但二者存在一定距離，說明在團棵期單作與套作土壤細菌群落存在著一定差異。樣品BB2.2，BB3.2和BB4.1均分布在PC2的正值區(qū)域，PC1的負值區(qū)域，但BB2.2與BB3.2和BB4.1距離較遠，差異較大，而BB3.2與BB4.1之間距離較近，兩者非常相似；同時樣品AB3.2與AB4.1和A2.2均分布在PC2的負值區(qū)域，但分處在PC1的正負值區(qū)域，且間隔位置較大，AB4.1和A2.2與A1.1間隔位置也較遠，進一步說明了隨著時間的推移，土壤細菌群落分布在顯著變化。總體來說土壤細菌群落結(jié)構(gòu)受環(huán)境影響較大，時間變異很大。

圖3 各樣品間細菌OTUs花瓣圖Fig.3 Flower-figure of OTUs for bacterial sample

對樣品真菌PCA主成分的分析結(jié)果如圖6所示，從圖6可以看出，主成分1(PC1)可解釋全部土壤樣品細菌群落多樣性的20.64 %，主成分2(PC2)可解釋土壤樣品細菌群落的16.77 %，兩者總計可解釋全部土壤樣品的37.41 %。樣品A1.1和BB1.1分布在PC1正值區(qū)域，PC2的負值區(qū)域，同樣樣品BB4.1和AB4.1均分布在PC2的正值區(qū)域，PC1的負值區(qū)域但是都存在一定差異。相反BB2.2分布在PC1及PC2的正值區(qū)域，而A2.2分布在PC1及PC2的負值區(qū)域，BB3.2與AB3.2雖然都分布在PC1的正值區(qū)域，但分處在PC2的正負值區(qū)域，并且A2.2與BB2.2和AB3.2與BB3.2兩兩位置間隔距離較遠，說明單作與套作在烤煙旺長期和現(xiàn)蕾期真菌群落結(jié)構(gòu)差異非常顯著。綜合以上所述，煙草根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受環(huán)境影響較大，時間變異較大，在不同生長期表現(xiàn)不同的群落結(jié)構(gòu)，之間差異顯著。

圖4 各樣品間真菌OTUs花瓣圖Fig.4 Flower-figure of OTUs for fungus sample

圖5 各樣品不同時期土壤細菌群落主成分分析Fig.5 PCA analysis of bacterial community in soils at different growth stages

2.4 各樣品細菌群落分布特征分析

選取各樣品中占各樣本細菌群落組成的95 %以上10個門的細菌，進行繪制群落結(jié)構(gòu)分布圖圖7。由圖7可以明顯看出無論是在套作還是在單作體系下煙草根際土壤微生物群落變形菌門是主要優(yōu)勢菌門，在煙草整個生長周期中相對百分比都大于25 %，占其細菌群落組成的1/4以上。其次是酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門和綠彎菌門。在現(xiàn)蕾期單作模式下變形菌門達到最大值(56.2 %)，與套作模式下(26.9 %)形成鮮明的對比，就整體而言放線菌門在套作體系下所占比例降低。酸桿菌門在在2種種植模式的團棵期所占比例最小，單作為9.6 %，套作為8.1 %，但單作體系下在現(xiàn)蕾期達到整個生長周期的峰值18.6 %，而套作體系下則是在旺長期達到峰值25.5 %。放線菌門在單作體系中各個生長期所占比例分別是團棵期(21.2 %)、旺長期(14.1 %)、現(xiàn)蕾期(12.3 %)、成熟期(15.6 %)，套作增加了其所占比例分別為團棵期(23.5 %)、旺長期(21.2 %)、現(xiàn)蕾期(17.6 %)、成熟期(20.1 %)。對于芽單胞菌門，綠彎菌門和硝化螺旋菌門在單作和套作中波動不大整體趨于穩(wěn)定。奇古菌門在單作體系下呈現(xiàn)先降低后又增高的趨勢，而在套作體系下恰好相反呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，厚壁菌門在單作的團棵期達到最大值4.4 %，而后就明顯降低，在套作體系中所占比例都低于單作團棵期，并且相對穩(wěn)定。通過圖7還可以看出通過萬壽菊與煙草套作處理大大降低擬桿菌門細菌微生物，并使其在各個生長周期中總體趨于穩(wěn)定狀態(tài)。

圖6 各樣品不同時期土壤真菌群落主成分分析Fig.6 PCA analysis of fungus community in soils at different growth stages

從屬分類水平上看單作與套作總共檢測分類出467個細菌屬(圖8)，細菌種類豐富但仍然還有大量細菌屬未分類，各樣品間菌屬分布差異很大。在單作體系下主要菌屬的食堿菌屬(Alcanivorax)，海桿菌屬(Marinobacter)鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)，3個屬在團棵期占絕對優(yōu)勢分別是5.65 %、5.45 %、4.49 %，而在套作體系下卻相反。

2.5 各樣品真菌群落分布特征分析

檢測到8個樣品共涉及子囊菌門(Ascomycota)，接合菌門(Zygomycota)，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，壺菌門(Chytridiomycota)，Incertae_sedis_Fungi，聚合菌門(Glomeromycota)6個菌門。由圖9可知，煙草根際土壤真菌群落組成中首要菌門是子囊菌門，占所有菌門的80 %以上，其次是接合菌門和擔(dān)子菌門，它們所占比例雖小但均在2.83 %以上。接合菌門主要存在于旺長期而后，通過套作處理可適當(dāng)降低其比例，單作中擔(dān)子菌門首先略微下降后又增加，在成熟期又微降至7.29 %，而套作處理的擔(dān)子菌門主要存在于團棵期，在整個生長周期中呈逐漸下降趨勢。

從屬分類水平看8個樣品總共涉及171個真菌屬，各樣品間菌種屬組成差異顯著。從圖10可以看出，煙草根際微生物種群中第1位菌屬是毛殼屬(Chaetomium)，第2位菌屬是曲霉屬(Aspergillus)。在團棵期是根際真菌微生物群落含量最豐富的時期，從圖中還可以明顯看出單作成熟期Microidium屬真菌數(shù)量與其它3個時期相比較高為AB4.1(5.32 %)，通過套作之后可使其數(shù)量降低。套作增加團棵期錐蓋傘屬(Conocybe)的菌種數(shù)量為BB1.1(4.16 %)。

圖7 門分類水平各樣品土壤細菌菌群結(jié)構(gòu)分布Fig.7 Structure map of soil bacteria on the level of phylum from samples

圖8 屬分類水平各樣品土壤細菌菌群結(jié)構(gòu)分布Fig.8 Structure map of soil bacteria on the level of genus from samples

3 討 論

近幾年迅速發(fā)展起來的Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)相比較第一代Sanger測序技術(shù)具有通量高，大規(guī)模測序成本低，文庫覆蓋率高等特點[20-22]，非常適合用于土壤微生物菌種鑒定。真菌的ITS區(qū)域進化較快，種間特異性明顯，種內(nèi)相對保守，且序列長度適中，可以從不太長的序列中獲取更多信息，快速準確地鑒定真菌菌種[23-24]。故本研究通過運用Illumina MiSeq第二代測序技術(shù)對單作煙草和萬壽菊-煙草套作體系下不同生長周期根際8個土樣的16S-V4和ITS1變異區(qū)進行PCR擴增測序。

本研究通過16S-V4區(qū)測序結(jié)果多樣性分析發(fā)現(xiàn)文庫覆蓋率在93.9 %～96.6 %，表明測序結(jié)果很接近真實環(huán)境中細菌多樣性和物種豐富度。其中香農(nóng)指數(shù)(Shannon)在旺長期先降低又升高，隨后在成熟期又下降，在現(xiàn)蕾期達到最大值，表明在整個生長周期中細菌群落物種多樣性差異很大。Chao1指數(shù)從團棵期到現(xiàn)蕾期在逐漸增加到成熟期降低，而套作處理則是在旺長期以前下降之后增加，這可能是隨著植株生長各類細菌不斷積累到了成熟期植株組織成熟脫落影響細菌生物活性，而套作處理可能是在旺長期后萬壽菊根際分泌一些不利于細菌生長的物質(zhì)所以降低了其物種種類。對各樣品間細菌群落多樣性分析發(fā)現(xiàn)有752個OTUs是單作與套作兩個處理所共有，并且二者獨有OTUs均在現(xiàn)蕾期達到峰值。本研究還發(fā)現(xiàn)萬壽菊-煙草套作體系各生長期根際細菌的變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)是其三大優(yōu)勢菌門與單作體系下一致，并且主要以變形菌門(Proteobacteria)的α變形菌綱(Alphaproteobacteria)的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和γ變形菌綱(Gammaproteobacteria)的食堿菌屬(Alcanivorax)，海桿菌屬(Marinobacter)為主。

圖9 門分類水平各樣品土壤真菌菌群結(jié)構(gòu)分布Fig.9 Structure map of soil fungus on the level of phylum from samples

圖10 屬分類水平各樣品土壤真菌菌群結(jié)構(gòu)分布Fig.10 Structure map of soil fungus on the level of genus from samples

在對真菌ITS1區(qū)序列測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個檢測樣品文庫覆蓋率(Coverage)均在99.2 %以上，香農(nóng)指數(shù)(Shannon)在生長周期中都呈現(xiàn)先升高又降低最后再升高的趨勢，但與單作相比較套作中Chao1指數(shù)幾乎都大于單作，表明根際真菌群落在各個生長時期物種多樣性不一，可以通過套作處理提高真菌群落物種種類。對各樣品間真菌群落多樣性分析發(fā)現(xiàn)有162個OTUs是兩處理所共有的，二者獨有OTUs均在成熟期達到峰值。在通過對各個生長期根際土樣真菌群落組成中發(fā)現(xiàn)，在煙草整個生長周期里根際真菌群落3大優(yōu)勢菌門分別是子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，其中主要以子囊菌門(Ascomycota)的糞殼菌綱(Sordariomycetes)中的毛殼屬(Chaetomium)及炭疽菌屬(Colletotrichum)和散囊菌綱(Eurotiomycetes)中的曲霉屬(Aspergillus)為主。

4 結(jié) 論

通過對細菌16S-V4區(qū)和真菌ITS1區(qū)的測序注釋分析全面了解萬壽菊-煙草套作體系下不同生育期微生物種類變化情況，套作雖在不同生育期改變植煙環(huán)境土壤微生物多樣性及物種數(shù)量，但不能完全改變植煙土壤環(huán)境微生物種類組成。本研究檢測到很大比例的未分類菌群，說明還有大量未知微生物資源有待發(fā)掘。

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