胡乃霞 石巖 徐誠 張謙 尚紅記 王安營 李蘭華 劉運林

1泰安市中心醫(yī)院（山東泰安271000）；2泰安市第一人民醫(yī)院（山東泰安271000）；3泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院（山東泰安271000）

放射性腦損傷（radiation injured brain，RIB）是腦組織受到射線輻射后產(chǎn)生的直接或繼發(fā)性損傷，多見于鼻咽癌放療后［1］，目前仍缺乏有效的治療手段。本課題組以往的研究顯示：射線可對RIB大鼠造成行為學及腦組織改變，射線也能誘發(fā)血管內(nèi)皮細胞的凋亡、壞死。姜黃素對放射性內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用，為探討姜黃素對射線損傷的腦組織是否具有保護作用，故進行了本次實驗研究。本實驗應用姜黃素治療RIB大鼠，觀察各組大鼠行為學及組織病理學改變，有望闡明姜黃素對RIB大鼠的保護作用及機制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料成年健康雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量（180±10）g，由濟寧魯抗實驗中心提供（動物合格證編號3700920004220）。主食為顆粒型普通大鼠飼料，室溫為20～23℃，晝夜節(jié)律以燈光控制，明暗交替12 h/12 h，實驗過程中大鼠攝食飲水過程由大鼠自行控制，不加人工干預，采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為對照組、輻射組、治療組。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制作將120只SD雄性大鼠隨機分為3組，每組40只，分為對照組、輻射組、治療組。所有大鼠給予10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射，麻醉成功后，對照組僅擺體位，不給予射線照射，僅給予同劑量的藥物溶解介質(zhì)。其余2組，在鉛模保護下，采用直線加速器進行垂直單次照射大鼠全腦，電子束6 Mev，劑量率300 cGy/min，照射源與大鼠體表距離30 cm。治療組建模成功后給予姜黃素腹腔注射，從建模第1天給予姜黃素100 mg/（kg·d）腹腔注射，第30天后應用Morris水迷宮實驗和逃避跳臺實驗測試各組大鼠的學習記憶能力。經(jīng)放射線照射后輻射組及對照組，腹腔注射相同體積的姜黃素溶劑MDSO作為安慰劑，各組分別在完成Morris水迷宮測試后各取10只處死行血腦屏障通透性檢測。其余大鼠取腦組織固定，石蠟切片，進行組織病理及免疫組化染色。

1.2.2 行為學檢測跳臺逃避實驗中，記錄每只大鼠5 min內(nèi)錯誤次數(shù)及逃避潛伏期作為學習記憶能力的評價指標。Morris水迷宮實驗包括定位航行實驗和空間探索實驗，通過記錄原平臺象限停留時間、總路徑長度、逃避潛伏期、錯誤次數(shù)評價各組大鼠學習記憶能力改變。

1.2.3 血腦屏障通透性檢測每只大鼠經(jīng)左心室生理鹽水灌注、取腦、離心、取上清，采用分光光度計檢測吸光度，對比標準曲線查出大鼠腦組織伊文氏藍（Evans blue，EB）濃度，按公式計算腦組織EB含量（μg/g），EB含量＝EB 濃度（μg/mL）×3 mL（甲酰胺體積）/腦組織質(zhì)量（g）。

1.2.4 組織病理學檢查方法采用多聚甲醛經(jīng)左心室灌注外固定鼠腦，每組在相應時間點取20只，10只進行海馬區(qū)石蠟切片測定膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP），另10只進行石蠟切片免疫組化染色測定環(huán)核苷酸-3′磷酸水解酶（cyclic nucleotide 3′phosphohydrolase，CNPase）。

1.3 統(tǒng)計學方法使用SPSS 20.0軟件包進行處理，多組間的比較應用單因素方差分析，兩兩比較可用SNK檢驗，兩組間比較采用t檢驗，結(jié)果以均數(shù)±標準差來表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 照射后大鼠一般情況對照組大鼠精神狀態(tài)正常，進食及飲水情況良好，動作靈活，對刺激反應迅速。輻射組大鼠表現(xiàn)為精神差，進食飲水較對照組顯著減少，動作遲緩，對刺激反應較遲鈍，性格改變，兇悍、煩躁、相互攻擊，出現(xiàn)頭部照射區(qū)毛發(fā)脫落、稀疏，個別大鼠表現(xiàn)為呼吸急促，皮膚溫度下降。治療組在建模后3 d內(nèi)，出現(xiàn)精神差、行動遲緩、飲食減少等表現(xiàn)，3～4 d后逐漸好轉(zhuǎn)，10 d左右恢復正常。

2.2 大鼠行為學檢測結(jié)果

2.2.1 跳臺逃避實驗造模后第30天，各組大鼠均行跳臺逃避試驗，實驗第1天大鼠錯誤次數(shù)代表大鼠學習能力，實驗第2天中，大鼠錯誤次數(shù)及逃避潛伏期代表大鼠記憶能力。第1天實驗中，輻射組較對照組錯誤次數(shù)明顯增多，治療組較輻射組錯誤次數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。第2天實驗中，輻射組大鼠逃避潛伏期較對照組顯著縮短，錯誤次數(shù)明顯增加（P＜0.05）。治療組與輻射組比較，逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05），錯誤次數(shù)明顯減少（P＜0.05）。見表1。

表1 跳臺逃避實驗結(jié)果Tab.1 Platform escape test result ±s

表1 跳臺逃避實驗結(jié)果Tab.1 Platform escape test result ±s

注：與對照組比較，#P＜0.05；與輻射組比較，*P＜0.05

2.2.2 Morris水迷宮實驗輻射組大鼠學習記憶能力較對照組明顯下降（P＜0.05），治療組較輻射組顯著提高（P＜0.05），說明射線對各組大鼠學習記憶能力有損害，而姜黃素可改善射線照射后大鼠的學習記憶能力（表2）。

表2 Morris水迷宮實驗結(jié)果Tab.2 Morris water maze test result ±s

表2 Morris水迷宮實驗結(jié)果Tab.2 Morris water maze test result ±s

注：與對照組比較，#P＜0.05；與輻射組比較，*P＜0.05

組別 例數(shù)對照組輻射組治療組路徑長度（cm）1 079±71 1 909±158#1 192±131*40 40 40學習能力逃避潛伏期（s）44.50±3.84 79.75±3.51#41.67±4.17*錯誤次數(shù)15.29±0.79 35.51±3.56#14.31±1.28*記憶能力停留時間（s）32.30±1.78 17.12±0.94#31.04±1.87*

2.3 血腦屏障通透性實驗輻射組大鼠腦組織EB含量較對照組顯著增多（P＜0.05），治療組較輻射組EB含量顯著減少（P＜0.05），提示射線能夠損傷大鼠血腦屏障使其通透性增加，姜黃素對射線引起的RIB大鼠血腦屏障損傷有保護作用（表3）。

表3 各組大鼠腦組織EB含量Tab.3 EB content of brain tissue in each group ±s，μg/g

表3 各組大鼠腦組織EB含量Tab.3 EB content of brain tissue in each group ±s，μg/g

注：與對照組比較，#P＜0.05；與輻射組比較，*P＜0.05

2.4 大鼠海馬區(qū)HE染色對照組無明顯病理改變。輻射組可見不同程度的海馬及大腦皮層神經(jīng)元的變性，細胞核內(nèi)染色質(zhì)濃集，胞漿紅染，胞體萎縮，細胞內(nèi)可見空泡變性；可見白質(zhì)區(qū)組織結(jié)構(gòu)梳松、血管擴張和血管周圍間隙擴大等表現(xiàn)。姜黃素組細胞形狀規(guī)則，有層次感，未查見炎性細胞浸潤，無結(jié)締組織增生，與對照組比較差異不大。見圖1。

2.5 各組大鼠病理學變化

2.5.1 GFAP免疫組化染色結(jié)果在海馬區(qū)域中，星形膠質(zhì)細胞的細胞漿和細胞膜呈棕褐色，為陽性細胞。星形膠質(zhì)細胞密度高，胞體圓而飽滿，輪廓清晰，突起粗、長，均勻深染（圖2）。在200倍顯微鏡視野下，計數(shù)各組大鼠海馬區(qū)域內(nèi)的GFAP陽性細胞數(shù)。治療組與輻射組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），輻射組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

圖1 大鼠腦組織HE染色Fig.1 HE staining of rats brain tissue（× 200）

圖2 GFAP免疫組化染色Fig.2 Immunnohistochemical staining of GFAP cells(×200)

2.5.2 大鼠海馬區(qū)CNPase免疫組化染色在200倍顯微鏡視野下，陽性細胞胞漿呈黃褐色，圓形或卵圓形，少數(shù)有短的、突起的胞體，細胞較密集，細胞界限不清（圖3）；在白質(zhì)區(qū)域表達強陽性，治療組與輻射組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），輻射組與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表5。

圖3 CNPase免疫組化染色Fig.3 Immunnohistochemical staining of CNPase cells(×200)

表4 GFAP陽性細胞個數(shù)Tab.4 Number of GFAP cells x s，個

表5 CNPase陽性灰度值Tab.5 Grave value of positive CNPase cells ±s

表5 CNPase陽性灰度值Tab.5 Grave value of positive CNPase cells ±s

注：與輻射組比較，*P＜0.05；與對照組比較，#P＜0.05

CNPase陽性灰度值0.30±0.02 0.86±0.04#0.30±0.01*組別對照組輻射組治療組例數(shù)10 10 10

3 討論

在我國，RIB成為放射治療后的嚴重遠期并發(fā)癥之一，發(fā)病率可達3/10萬，病死率高達0.7/10萬，局部高發(fā)地區(qū)如廣東省高于世界平均水平40倍［2］。其發(fā)病機制尚不明確，目前主要在血管損傷、神經(jīng)元及神經(jīng)干細胞損傷、免疫效應等方面進行探討［3］。本課題組早期實驗研究及本次實驗結(jié)果均提示輻射可引起大鼠學習記憶能力的降低，這和國外研究［4］結(jié)果一致。

本課題組既往研究證實了姜黃素對血管內(nèi)皮細胞輻射后損傷有保護作用，且與Merk1/2信號系統(tǒng)有關［5］，預實驗結(jié)果也證實姜黃素對離體神經(jīng)干細胞放射性損傷也有保護作用。但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，有關姜黃素作用機制的研究非常缺乏［6］。姜黃素為姜黃的主要成分，具有抗炎、抗氧化、清除自由基等多種功能，對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等都具有藥理作用［7］。本次實驗觀察到早期予以姜黃素治療后可顯著提高模型鼠的學習記憶能力，治療組大鼠腦組織中EB含量明顯降低，證明姜黃素對促進、改善模型鼠學習記憶功能、改善血腦屏障損傷的作用確實有效。內(nèi)皮細胞破壞是血腦屏障破壞的啟動環(huán)節(jié)，腦損傷產(chǎn)生后釋放的炎癥因子可以增加其血腦屏障的通透性，血腦屏障通透性的增加使血液中白細胞在損傷腦組織中的聚集進一步增加，從而加重炎癥反應［8］。研究［9］顯示，姜黃素治療缺血性腦損傷的作用機制包括減輕氧化應激引起的損傷、促進受損傷血腦屏障的恢復。姜黃素保護血腦屏障的機制是否與之相同，還需進一步研究。

實驗可觀察到輻射組大鼠腦組織GFAP表達明顯增加，GFAP是星形膠質(zhì)細胞的重要成分，在細胞活化時可大量表達，能夠維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常的結(jié)構(gòu)和功能，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損害時反應活躍［10］。既往研究［11］顯示在腦組織接受射線的初期，活化的星形膠質(zhì)細胞可在損傷區(qū)域周圍產(chǎn)生膠質(zhì)界膜，有利于損傷的恢復，但星形膠質(zhì)細胞過度膠質(zhì)化時，可形成機械屏障，阻礙神經(jīng)組織的結(jié)構(gòu)修復以及功能的恢復。本實驗結(jié)果提示射線可引起GFAP表達增加，與前人研究結(jié)果一致。星形膠質(zhì)細胞的反應性增生現(xiàn)象并不能完全發(fā)揮星形膠質(zhì)細胞的正常生理功能［12］，這可能是RIB大鼠血腦屏障破壞及學習記憶能力差的原因之一。經(jīng)姜黃素治療后GFAP表達明顯降低，推測姜黃素可通過下調(diào)GFAP的表達來減少星形膠質(zhì)細胞的增生，從而改善大鼠學習記憶能力。

實驗中輻射組大鼠海馬區(qū)CNPase陽性灰度值較對照組明顯降低。CNPase為髓鞘的構(gòu)成成分，在形成髓鞘的早期即可出現(xiàn)，其在少突膠質(zhì)細胞中含量大約占髓鞘的一半，在少突膠質(zhì)細胞的損傷中起關鍵作用［13］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)放射性損傷前期研究中證實，血管及少突膠質(zhì)細胞受損傷在該病的發(fā)生與發(fā)展過程中起了主要作用，少突膠質(zhì)細胞為中樞神經(jīng)系統(tǒng)成髓鞘膠質(zhì)細胞，能夠合成髓磷脂包繞于神經(jīng)纖維的軸突從而形成髓鞘，損傷晚期較為典型的病理學特征是脫髓鞘改變以及蛋白質(zhì)凝固性壞死。本次實驗結(jié)果提示射線可引起大鼠腦組織CNPase的表達降低，該結(jié)果與前人研究一致［14］，符合少突膠質(zhì)細胞的放射性損傷效應［15］。本實驗觀察到姜黃素組CNPase陽性灰度值較輻射組明顯增高，提示姜黃素可上調(diào)CNPase的表達，推測姜黃素通過上調(diào)CNPase的表達減輕少突膠質(zhì)細胞的脫髓鞘，從而起到對放射性損傷的保護作用。

綜上所述，姜黃素對RIB大鼠血腦屏障有保護作用，并下調(diào)GFAP、上調(diào)CNPase的表達，可能是姜黃素改善RIB大鼠學習記憶能力的途徑之一，為RIB的治療提供更多思路。但是，本實驗未能闡明姜黃素通過何種機制調(diào)節(jié)GFAP、CNPase的表達，這將有待進一步研究。

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