趙艷玲 韓瑤 靳玉蕾

摘 要：? 銅鋅超氧化物歧化酶（CuZnSOD）是一種清除超氧陰離子自由基的金屬酶，與多種抗逆性相關(guān)。該研究利用CaMV35S啟動(dòng)子融合巨尾桉EuCuZnSOD1基因通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入巨尾桉中，經(jīng)卡那霉素初步篩選和PCR鑒定，得到10株轉(zhuǎn)基因陽性植株。結(jié)果表明：通過-13.1 ℃暗處理5 h的抗寒性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)40和41號植株在低溫下無葉片萎蔫現(xiàn)象，組培室培養(yǎng)100 d后全株存活無白化葉片，說明這兩株轉(zhuǎn)基因巨尾桉的抗低溫和凍害后恢復(fù)能力較強(qiáng)。在4 ℃低溫脅迫下跟蹤監(jiān)測轉(zhuǎn)基因溫室苗的SOD酶活性發(fā)現(xiàn)，與對照相比轉(zhuǎn)基因植株的SOD酶比活力無規(guī)律性且變化不大，但是相同條件下實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果表明抗寒性較強(qiáng)的40和41號植株在常溫下EuCuZnSOD1的表達(dá)量較對照增加了約9倍，4 ℃處理36 h后EuCuZnSOD1的表達(dá)量相比對照植株分別增加了16倍和36倍，說明EuCuZnSOD1在低溫脅迫下的表達(dá)量增加提高了巨尾桉的耐寒性。分析轉(zhuǎn)基因組培苗全株的硫酸木質(zhì)素含量，表明EuCuZnSOD1高表達(dá)不影響甚至降低了巨尾桉的木質(zhì)素含量，40號植株的木質(zhì)素含量與對照相同，而41號整株植株的木質(zhì)素含量相比對照降低了56%，其他檢測轉(zhuǎn)基因植株的木質(zhì)素含量均有不同程度的降低。該研究結(jié)果表明巨尾桉中大量表達(dá)EuCuZnSOD1基因可以提高巨尾桉的抗寒能力以及寒害后的恢復(fù)能力，不影響甚至可能是負(fù)調(diào)控了轉(zhuǎn)基因巨尾桉的木質(zhì)素生物合成。

關(guān)鍵詞： 巨尾桉， 銅鋅超氧化物歧化酶， 轉(zhuǎn)基因， 抗寒性， 硫酸木質(zhì)素

中圖分類號：? Q945.78

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2018）01-0101-08

Over-expression of cytosolic copper/zinc superoxide dismutase gene and increase cold-tolerance in Eucalyptus grandis × E. ophylla

ZHAO Yanling， HAN Yao， JIN Yulei

（ College of Chemical Engineering， Huaqiao University， Xiamen 361021， Fujian， China ）

Abstract：? Copper/zinc superoxide dismutases are important antioxidant enzymes to guard cells against superoxide toxicity. The over-expression of CuZnSOD can improve the resistance and recovery ability of plants to abiotic stresses such as salt， drought， cold and high temperature stress. The plant genome encodes three types of CuZnSOD， the CuZnSOD1 in cytoplasm， the CuZnSOD2 in chloroplast and the CuZnSOD3 in peroxisome or extracellular. The cytosolic EuCuZnSOD1 gene was cloned from Eucalyptus grandis × E. ophylla （GenBank Accession Number： JX138573） and the biological function was verified by prokaryotic expression system. The fusion vector of sense EuCuZnSOD1 gene derived by CaMV35S promoter was constructed and transformed to Eucalyptus grandis × E. ophylla by Agrobacterium. Using Kanamycin selection and PCR analysis， ten transgenic eucalyptus lines were obtained. Compared with the control plants the tissue culture transgenic eucalyptus No. 40 and No. 41 could be well tolerant in -13.1 ℃ for 5 h and recovery without obvious damage. There was no distinct increase in SOD enzyme activity in transgenic plant paralleled with wild plant under room temperature and 4 ℃ for 48 h. However， the real-time PCR analysis showed that the expression of? EuCuZnSOD1 was raised to about nine times higher than wild line under room temperature. After 4 ℃ for 36 h， the expression of EuCuZnSOD1 in No. 40 and No. 41 line was respectively increased about 16 and 36 times higher than the wild plant and then down to the normal level at 4 ℃ for 48 h. The data indicated that the increased expression of EuCuZnSOD1 improves the cold tolerance of Eucalyptus. The klason lignin content of transgenic Eucalyptus was reduced especially the No. 41 Eucalyptus was decreased to 56% of the control plant except for the No. 40 plant was no significantly different from the control plant. In conclusion， over-expression of the cytosolic EuCuZnSOD1 in Eucalyptus grandis × E. ophylla could enhance the cold-tolerance and improve the recovery ablity.

Key words： Eucalyptus grandis × E. ophylla， copper/zinc-superoxide dismutases， transgenosis， cold-tolerance， klason lignin

桉樹是世界三大用材樹種之一，其種植面積已經(jīng)占世界人工林面積的三分之一，是一種極具價(jià)值的經(jīng)濟(jì)林。但是，低溫、其它環(huán)境脅迫、人工除草等高成本因素嚴(yán)重影響了桉樹人工林的發(fā)展，而選育良種、培育新品種則是解決這一問題的有效途徑。基因工程育種具有高效性和目標(biāo)性強(qiáng)等特點(diǎn)，可以加速優(yōu)質(zhì)、高抗桉樹新品種的選育進(jìn)程。目前，已經(jīng)有澳大利亞、日本、巴西和中國等獲得了轉(zhuǎn)基因桉樹。

目前，桉樹抗寒分子機(jī)理研究較少，主要集中在抗寒轉(zhuǎn)錄因子CBF的功能研究，首先，法國圖盧茲大學(xué)的Teulieres課題組克隆了巨桉的CBF基因（Kayal et al，2006），研究了CBF基因與抗寒性的關(guān)系（Navarro et al，2009），將巨桉CBF1基因轉(zhuǎn)入雜交桉樹中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因桉樹除了抗寒能力增強(qiáng)之外，還表現(xiàn)出生長緩慢、保水能力增強(qiáng)等常青闊葉樹所具備的生理特點(diǎn)（Navarro et al，2011）;隨后分析了AP2/ERF基因家族的功能，發(fā)現(xiàn)DREB1/CBF與桉樹的寒害逆境相關(guān)（Cao et al，2015），后通過高通量的qPCR技術(shù)研究了巨桉的CBF和DREB2與桉樹冷、熱和干旱逆境的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CBF調(diào)節(jié)桉樹的抗逆與生長（Nguyen et al，2017）。將巨桉的低溫脅迫響應(yīng)基因EgrCR（徐鳳華等，2016）轉(zhuǎn)化擬南芥，提高了擬南芥的抗凍性，證明了與桉樹的抗寒性相關(guān)。此外，還開展了低溫脅迫下的尾巨桉和鄧恩桉轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究（Liu et al，2014）和巨桉的莖在短時(shí)寒害下的蛋白質(zhì)組學(xué)研究（Leonardi et al，2015）。

SOD活性可作為篩選桉樹抗寒性的一個(gè)生理指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)不同種類的桉樹應(yīng)對低溫逆境時(shí)其SOD的活性變化差異明顯（劉友全等，2000）。例如尾巨桉和鄧恩桉對低溫具有不同的響應(yīng)特性，低溫脅迫下SOD的活性均有升高，且耐寒的鄧恩桉的SOD活性高于尾巨桉（劉奕清，2015）。綜上所述，研究表明SOD的活性與桉樹對低溫脅迫的抵抗能力成正相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)室成功克隆了巨尾桉的EuCuZnSOD基因（GenBank Accession Number： JX138573），通過原核表達(dá)，證明該基因具有生物學(xué)功能（趙艷玲和周利建，2015）。本研究通過基因工程手段獲得過量表達(dá)EuCuZnSOD的巨尾桉轉(zhuǎn)基因植株，研究超表達(dá)EuCuZnSOD與桉樹抗寒能力的關(guān)系，為定向培育耐低溫桉樹新品種提供直接的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

EuCuZnSOD 為本研究實(shí)驗(yàn)室克隆并保存（GenBank Accession Number： JX138573）。巨尾桉無菌苗、pBI121載體、JM109菌株、農(nóng)桿菌LBA4404為本實(shí)驗(yàn)室保存。PCR體系、內(nèi)切酶等均購自Takara公司，其他試劑購自上海生工。引物由廈門精聚公司合成。

1.2 方法

1.2.1構(gòu)建植物二元表達(dá)載體與農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)基因桉樹 pBI121和pMD-CSD質(zhì)粒BamH I/Sac I雙酶切，雙酶切產(chǎn)物由TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit回收，T4 DNA ligase連接片段，雙酶切驗(yàn)證和測序檢測陽性克隆載體。將pBIEuCSD轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，參照（周利建和趙艷玲，2012）葉盤法轉(zhuǎn)化巨尾桉，50 mg·L-1 Cef，5 mg·L-1 Kan，初步篩選轉(zhuǎn)基因桉樹。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因巨尾桉的PCR檢測 CTAB法提取轉(zhuǎn)基因桉樹基因組DNA，引物1：5′-ATGGTGAAGGCCGTTGCCGTCC-3′;引物2：5′-TTAGCCTTGCAGACCAATAATAC-3′ 進(jìn)行EuCuZnSOD基因的PCR擴(kuò)增。以CaMV35s啟動(dòng)子部分序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行二次驗(yàn)證，引物3：5′-CAGGTCCCCAGATTAG CCTT-3′，引物4：5′-CGTGTTCTCT-CCAAATGA-3′，PCR反應(yīng)程序如下：預(yù)變性94 ℃，5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因巨尾桉的抗寒能力實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)基因組培苗-13.1 ℃冰箱暗處理，逆境處理3.5 h觀察植株情況，直到5 h，取出拍照后置于組培室進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)， 3 d和100 d后觀察植株生長狀況。

1.2.4 NBT法檢測SOD酶活性 SOD酶活性測定方法參照趙艷玲和周利建（2015）。植物材料取盆栽轉(zhuǎn)基因巨尾桉植株葉片，測定的條件分別是25 ℃、4 ℃恒溫氣候箱中培養(yǎng)36 h和48 h。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因植株EuCuZnSOD1表達(dá)量 巨尾桉葉片總RNA用Takara公司的RNA提取試劑盒，利用Takara SYBR ExScript 試劑和羅氏LightCycler 480儀器，以桉樹4個(gè)樣本的cDNA為模板，內(nèi)參基因?yàn)榫尬茶?8S rRNA（171 bp），引物設(shè)計(jì)分別為EuCSDF：5′-GGAAATGTCACTGTTGGTGC-3′;EuCSDR：5′-TCATCCGGATCAGCATGGAC-3′;Eu18SF：5′-CGCGCTACACTGATGTATTC-3′;Eu18SR：5′-GTACAAAGGGCAGGG ACGTA-3′，反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95 ℃，30 s;變性95 ℃，5 s;退火60 ℃，20 s，40個(gè)循環(huán)，最后延伸65 ℃，15 s，每個(gè)反應(yīng)包括3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 硫酸木質(zhì)素含量測定 取巨尾桉轉(zhuǎn)基因組培苗全株做硫酸木質(zhì)素含量測定，參照趙艷玲等（2012）的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)pBIEuCSD巨尾桉植株的獲得

pBIEuCSD植物的二元表達(dá)載體質(zhì)粒通過BamHⅠ和SacⅠ雙酶切驗(yàn)證連接成功，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)基因巨尾桉，圖1所示為整個(gè)轉(zhuǎn)化過程的部分圖片，芽分化在培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 d后，不定芽從愈傷組織中分化（圖1：A），芽長至2 cm移至生根培養(yǎng)基中繼續(xù)抗性篩選，抗Kan的轉(zhuǎn)基因巨尾桉正常生長（圖1：B）并生根（圖1：C），經(jīng)初步篩選共得到46株抗性植株。

2.2 PCR檢測pBIEuCSD轉(zhuǎn)基因巨尾桉

對初步篩選所得到的46株轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測。EuCuZnSOD1克隆自巨尾桉，以該基因作為陽性指標(biāo)檢測到31株陽性植株，存在假陽性問題。以CaMV35S啟動(dòng)子上的部分序列為模版設(shè)計(jì)引物，對得到的31株檢測陽性植株進(jìn)行二次PCR驗(yàn)證，若為陽性植株應(yīng)有約900 bp的目的片段。從圖2可以看出，有10株轉(zhuǎn)基因植株在900 bp左右有條帶，通過雙PCR驗(yàn)證，最終得到pBIEuCSD轉(zhuǎn)基因巨尾桉陽性植株10棵。

2.3 pBIEuCSD轉(zhuǎn)基因巨尾桉抗寒性分析

通過不同的低溫設(shè)置研究組培苗的最低耐受溫度， 經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到-13.1 ℃暗處理3.5 h后普通組培苗萎蔫現(xiàn)象嚴(yán)重甚至死亡。本實(shí)驗(yàn)將生長狀況相同的轉(zhuǎn)基因陽性和陰性巨尾桉放置在同一組培瓶中培養(yǎng)至生根，于-13.1 ℃放置3.5 h，觀察發(fā)現(xiàn)36和47號轉(zhuǎn)基因植株有明顯凍傷，停止低溫處理，其余的轉(zhuǎn)基因陽性植株無萎蔫現(xiàn)象，重新放回-13.1 ℃放置5 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)49、52、53、55、44號轉(zhuǎn)基因陽性植株在凍害后表現(xiàn)為莖尖萎蔫，組培室培養(yǎng)72 h后植株莖上部1/3處萎蔫。40、41和42號巨尾桉凍害后植株無明顯凍傷，組培室培養(yǎng) 72 h后40號植株無萎蔫現(xiàn)象，41和42號植株莖尖有所萎蔫，不換瓶培養(yǎng)100 d后，40和41號巨尾桉全株成活，而42號植株底部葉片白化，重新發(fā)芽，如圖3所示。

表1統(tǒng)計(jì)了凍害后轉(zhuǎn)基因植株的恢復(fù)程度，經(jīng)-13.1 ℃凍害實(shí)驗(yàn)的植株光照培養(yǎng)100 d后，轉(zhuǎn)基因陽性植株只有47號全株白化死亡，對照植株有4株完全死亡;底部葉片白化但重新發(fā)芽的轉(zhuǎn)基因植株有4株，陰性對照有7株;有5株轉(zhuǎn)基因植株完全沒有白化現(xiàn)象，生長良好，但是完全存活的陰性植株為0株，說明EuCuZnSOD1基因轉(zhuǎn)入巨尾桉后，確能增強(qiáng)植株的抗寒能力且低溫處理后的復(fù)壯能力強(qiáng)。

2.4 pBIEuSOD陽性轉(zhuǎn)基因植株SOD酶活檢測

參考劉奕清（2015）的方法，本研究在4 ℃氣候箱中對盆栽轉(zhuǎn)基因巨尾桉植株低溫脅迫處理，測定SOD酶活性。從圖4結(jié)果可以看出，通過組培獲得的盆栽苗的預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在48 h的冷脅迫過程中，前36 h低溫脅迫下SOD酶的比活力呈現(xiàn)出下降趨勢，36 h左右SOD酶比活力達(dá)到最低，之后開始升高。

常溫環(huán)境下，轉(zhuǎn)基因植株的SOD比活力最高的是36號植株，但是36號植株的抗凍能力較差?？箖瞿芰ψ顝?qiáng)的40和41號植株常溫下的SOD比活力和對照差異較小。4 ℃低溫脅迫下，巨尾桉抗凍能力較強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株40對低溫脅迫較敏感，36 h脅迫后SOD比活力相比室溫下的比活力降低了38%，48 h比活力比36 h的上升了2.1倍，對照植株比活力分別是降低了11%和上升了1.6倍。從酶比活力的分析發(fā)現(xiàn)巨尾桉轉(zhuǎn)基因植株的SOD酶活性與抗凍能力的關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)。

2.5 qPCR分析轉(zhuǎn)基因植株的EuCuZnSOD表達(dá)量

綜合抗寒性實(shí)驗(yàn)和酶活性測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取4株轉(zhuǎn)基因巨尾桉進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，包括酶活性最高但不耐凍的36號植株，最耐凍且酶活性對溫度敏感的40和41號植株，酶活性較高且較耐凍的52號植株，以盆栽苗的葉片為研究對象，選擇18S RNA作為內(nèi)參基因?qū)λ袠悠愤M(jìn)行歸一化處理，對不同樣品之間的EuCuZnSOD基因表達(dá)量進(jìn)行比較如圖5。常溫下耐寒能力強(qiáng)的40、41和52號轉(zhuǎn)基因巨尾桉的EuCuZnSOD表達(dá)量是對照植株的9～10倍，在4 ℃低溫脅迫下EuCuZnSOD表達(dá)量具有先升高后降低的特點(diǎn)，在4 ℃低溫脅迫36 h時(shí)抗凍能力較強(qiáng)的40和41號轉(zhuǎn)基因植株EuCuZnSOD的表達(dá)量分別升高到對照的16倍和36倍，較高的EuCuZnSOD的表達(dá)有利于植株抵御凍害。

2.6 轉(zhuǎn)基因植株的硫酸木質(zhì)素含量

將轉(zhuǎn)基因植株組培苗的全株，包括根，莖，葉一起磨粉，硫酸木質(zhì)素的含量測定結(jié)果見圖6，轉(zhuǎn)基因桉樹的硫酸木質(zhì)素含量除了40號和對照相比變化較小外，其它植株的木質(zhì)素含量都降低了，其中41號轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量比對照植株降低了56%。

3 討論與結(jié)論

桉樹是重要的紙漿林木，在林業(yè)生產(chǎn)中有非常明顯的區(qū)域性。目前，低溫、鹽堿、重金屬等環(huán)境因素嚴(yán)重限制了桉樹人工林的推廣及發(fā)展。CuZnSOD與植物的抗逆性有著密切關(guān)系。對CuZnSOD的轉(zhuǎn)基因研究主要集中在耐鹽、耐旱、耐儲存、耐凍等能力的研究。研究發(fā)現(xiàn)克隆多抗花生的AhCuZnSOD基因，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草的抗鹽和抗旱能力明顯提高（Negi et al，2015）。小麥CuZnSOD基因TaSOD1.1和TaSOD1.2轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因植株抵御鹽脅迫能力增強(qiáng)（張海娜等，2008）。橡膠樹中過表達(dá)細(xì)胞質(zhì)CuZnSOD基因，獲得耐旱的轉(zhuǎn)基因橡膠樹（Leclercq et al，2012）。李子的胞質(zhì)CuZnSOD和APX轉(zhuǎn)入李子組培苗后，轉(zhuǎn)基因李子的快繁能力增強(qiáng) （Faiza et al，2013）。

CuZnSOD基因和CAT1在木薯中過表達(dá)，木薯的采后生理惡化現(xiàn)象最少延遲10 d（Xu et al，2013）。實(shí)驗(yàn)證明，將葉綠體CuZnSOD和APX基因轉(zhuǎn)入的甘薯具有較高的耐旱性且旱后恢復(fù)速度較快（Lu et al，2010），在鹽脅迫下CuZnSOD相比對照植株表達(dá)量增加了13.3倍，可耐受100 mmol·L-1 NaCl（Yan et al，2016），耐寒能力和耐受SO2的能力也有所增強(qiáng)（Kim et al，2015）。西伯利亞蓼銅伴侶蛋白基因（PsATX）和CuZnSOD共轉(zhuǎn)化的煙草耐鹽，且比轉(zhuǎn)單價(jià)基因植株具有更強(qiáng)的耐NaCl能力（馬靜等，2015）。本文的研究目標(biāo)是通過CuZnSOD的過表達(dá)提高巨尾桉的抗寒能力，同時(shí)CuZnSOD的過表達(dá)可能也會(huì)增強(qiáng)巨尾桉對其它逆境環(huán)境的耐受能力，這方面的工作需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)確定。

通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，可以研究CuZnSOD基因的表達(dá)量與低溫生理響應(yīng)的關(guān)系。qPCR結(jié)果表明，雖然36號植株的SOD酶活性很高，但是CuZnSOD的表達(dá)量很低?？购芰^強(qiáng)的40、41和52號植株的CuZnSOD表達(dá)量較大，意味著CuZnSOD的過表達(dá)與轉(zhuǎn)基因巨尾桉的抗寒能力正相關(guān)。轉(zhuǎn)基因40和41號凍害后的恢復(fù)能力較強(qiáng)，而36和52號植株出現(xiàn)了寒害后白化并重生的現(xiàn)象，從48 h內(nèi)的qPCR數(shù)據(jù)不能得出CuZnSOD表達(dá)量大與恢復(fù)能力有關(guān)，在組培苗-13.1 ℃凍害實(shí)驗(yàn)后的觀察數(shù)據(jù)中，72 h的觀察數(shù)據(jù)與最終的100 d的成活程度也是不同的，說明CuZnSOD的表達(dá)量與低溫脅迫后的恢復(fù)能力可能需要更長時(shí)間的跟蹤監(jiān)測數(shù)據(jù)。

通過硫酸木質(zhì)素含量的分析，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)細(xì)胞質(zhì)EuCuZnSOD基因沒有導(dǎo)致木質(zhì)素含量的升高，除了抗寒能力強(qiáng)的40號植株的木質(zhì)素含量與對照差別較小外，其他轉(zhuǎn)基因植株的木質(zhì)素含量都降低了，尤其是41號巨尾桉的組培苗整株的硫酸木質(zhì)素含量只有6.2%，這與擬南芥（Gill et al， 2010）中大量表達(dá)CuZnSOD增加木質(zhì)化的研究結(jié)果差異較大，具體原因還有待進(jìn)一步的研究確定。通過對巨尾桉CuZnSOD功能的研究，篩選得到了抗寒且低木質(zhì)素的轉(zhuǎn)基因巨尾桉，獲得既速生優(yōu)質(zhì)又多抗的桉樹新品系，使桉樹在冷涼的溫帶地區(qū)以及多種復(fù)雜逆境環(huán)境中的推廣種植成為可能。

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