丁夢(mèng)玥 ，馬曉菁 ，葉 鋒 ，劉 帥 ，薛新梅 ，宋迎春 ，加帕爾·哈斯木 ，易新萍 ，劉麗婭，孟肖瀟，馬俊杰 ，谷文喜*，鐘 旗*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊 830000；3.新疆尉犁縣畜牧獸醫(yī)工作站，新疆 尉犁縣 841500；4.新疆巴音郭楞蒙古自治州動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆 庫(kù)爾勒 841000）

藍(lán)舌?。╞luetongue，BT）是一種由呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的藍(lán)舌病病毒（BTV）引起的急性病毒性傳染病，是一種經(jīng)由吸血昆蟲庫(kù)蠓、伊蚊等媒介昆蟲叮咬傳播的、嚴(yán)重侵害反芻動(dòng)物的非接觸性蟲媒病[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定藍(lán)舌病為A類傳染病，我國(guó)規(guī)定為一類傳染病。藍(lán)舌病不僅可以通過(guò)昆蟲傳播，還可以通過(guò)精液和胎盤屏障垂直傳播。該病主要侵害綿羊，表現(xiàn)為體溫升高、口鼻腔黏膜水腫及舌發(fā)紺，有明顯的臨床癥狀，死亡率為5%～35%，亦可感染山羊、牛、鹿及其他野生反芻動(dòng)物，但多呈隱性感染，臨床癥狀不明顯[2-3]。

該病18世紀(jì)首次出現(xiàn)于南非好望角，隨后陸續(xù)蔓延至其他地區(qū)，至今除南極洲外，其他各大洲皆有藍(lán)舌病的流行，主要的疫區(qū)主要集中在歐洲、中東和北非這3大疫區(qū)[4]。目前發(fā)現(xiàn)藍(lán)舌病共有27種血清型(BTV-1～BTV-27)，型與型之間缺乏有效的交叉保護(hù)作用，不同血清型的流行情況與地域有著緊密聯(lián)系。我國(guó)已發(fā)現(xiàn)7種血清型，其中BTV-1型和BTV-16型為我國(guó)的主要致病血清型[5]。

新疆于1989年首次在全疆范圍內(nèi)進(jìn)行了藍(lán)舌病的流行病學(xué)調(diào)查，不同物種的總陽(yáng)性率為2.64%[6]，2012年再次對(duì)新疆8個(gè)地（州）進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，其中尉犁縣羊的陽(yáng)性率最高為3.33%[7]，這說(shuō)明新疆是廣泛存在藍(lán)舌病的，而且有感染率逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。本研究是在新疆尉犁縣建立一個(gè)藍(lán)舌病血清學(xué)檢測(cè)為陰性的哨兵動(dòng)物群，分別于2016年和2017年的7月-11月每周采血1次，進(jìn)行BTV血清抗體檢測(cè)，監(jiān)控哨兵動(dòng)物群藍(lán)舌病感染情況。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

BTV抗體檢測(cè)試劑盒（c-ELISA）和抗原檢測(cè)試劑盒（Ac-ELISA）由云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。TransZol Up總RNA提取試劑盒和EasyScriptROne-Step RT-PCR SuperMix試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 哨兵動(dòng)物群的建立及樣品的采集

對(duì)新疆尉犁縣某養(yǎng)殖場(chǎng)的羊進(jìn)行BTV血清學(xué)抗體檢測(cè)，選取檢測(cè)結(jié)果為陰性的10只山羊和10只綿羊組成哨兵動(dòng)物群。于2016年7月-11月每周采樣1次，共采集血清和肝素鈉抗凝血各303份。血清-20℃保存，抗凝血4℃保存。

1.3 引物合成

BTVVP7基因的引物序列由云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，引物序列:BTV-VP7 F:5'-GTTAAAAATCTATAGAGATG-3’/BTV-VP7 R:5’-GTAAGTGTAATCTAAGAGA-3’。

1.4 BTV血清學(xué)抗體檢測(cè)

按照BTV c-ELISA試劑盒說(shuō)明書，取出4℃保存的ELISA板條，設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照（PBST）各2孔，按2孔/樣加入待測(cè)血清，先后加入競(jìng)爭(zhēng)性抗體和酶標(biāo)二抗，孵育，洗板，加入TMB顯色液避光顯色10～15 min，加入終止液，用酶標(biāo)儀在OD450 nm處讀值，依照說(shuō)明書上的公式，計(jì)算血清樣品的抑制率。

1.5 病毒的分離

選取轉(zhuǎn)陽(yáng)樣品、轉(zhuǎn)陽(yáng)前一周樣品及轉(zhuǎn)陽(yáng)后一周樣品的肝素鈉抗凝血，加入1 mL PBS，洗滌5次，1000 r/min離心10 min，棄上清。再加入1 mL 1%雙抗的高純水，渦旋破碎紅細(xì)胞，孵育30 min，5000 r/min離心10 min，取上清接種于培養(yǎng)好的BHK-21細(xì)胞上，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，盲傳5代。對(duì)于出現(xiàn)CPE的孔，則吸取細(xì)胞液進(jìn)行后續(xù)研究，盲傳5代后未出現(xiàn)CPE的棄去。

1.6 病變細(xì)胞液中BTV抗原的檢測(cè)

按照BTV Ac-ELISA試劑盒說(shuō)明書，用試劑盒中的山羊抗BTV包被抗體包被ELISA板，洗滌，設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照（PBST）各2孔，按2孔/樣加入待測(cè)血清，放入溫箱37℃孵育1 h 30 min。洗板，依次加入兔抗BTV血清競(jìng)爭(zhēng)液，綿羊抗兔酶標(biāo)二抗，孵育，洗板，拍干。加入TMB顯色液，避光顯色10 min。加入終止液。用酶標(biāo)儀在OD450 nm處讀值。

1.7 病變細(xì)胞液BTV VP7基因片段的RT-PCR擴(kuò)增

用TransZol Up總RNA提取試劑盒提取病毒總RNA，用One-Step RT-PCR試劑盒，以變性后的總RNA為模板，以BTV-VP7 F和BTV-VP7 R為引物，擴(kuò)增BTV VP7基因片段。

反應(yīng)程序:45 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；（94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s）×40；72 ℃ 10 min；4℃保存。

2 結(jié)果

2.1 監(jiān)控群BTV血清學(xué)抗體檢測(cè)

2016年共采集羊血清303份，共檢測(cè)出2份陽(yáng)性血清，陽(yáng)性率為0.66%。這2份陽(yáng)性血清都為10月采集。

2.2 病毒的分離

在接種BHK-21細(xì)胞盲傳三代后，有14份樣品出現(xiàn)CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、團(tuán)聚、脫落，形成空斑，多數(shù)細(xì)胞死亡（圖1），表明接種的樣品中存在病毒粒子，致使BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)CPE。

圖1 接種分離株后BHK-21細(xì)胞病變

2.3 病變細(xì)胞液中BTV抗原的檢測(cè)

對(duì)出現(xiàn)CPE的14份細(xì)胞液進(jìn)行BTV抗原捕獲ELISA檢測(cè)，14份細(xì)胞液均為BTV陽(yáng)性，表明確實(shí)存在BTV粒子。

2.4 病變細(xì)胞液BTV VP7基因片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳分析BTV VP7基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在1156 bp處均有一條清晰目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相一致（圖2）。表明擴(kuò)增BTV VP7的基因片段，而引起CPE出現(xiàn)的病毒為BTV。

圖2 病變樣品BTV VP7基因片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 討 論

我國(guó)于1979年首次在云南省師宗縣檢測(cè)出綿羊藍(lán)舌，之后相繼在安徽省（1985年）、四川省（1989年）、湖北?。?983年）等29個(gè)省均檢出BTV血清陽(yáng)性畜。從1979年起直至1991年前，藍(lán)舌病的爆發(fā)區(qū)域還主要集中在長(zhǎng)江以南，1991年和1993山西省報(bào)道了藍(lán)舌病的感染情況[8，9]，由此可以看出從1979年我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)藍(lán)舌病開始，該病已經(jīng)漸漸跨越過(guò)長(zhǎng)江，向北傳播至華北地區(qū)和西北地區(qū)。新疆于1988-1989年首次采用瓊脂糖凝膠擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)方法對(duì)藍(lán)舌病進(jìn)行了普查，共普查17個(gè)地（州）86個(gè)縣（市），平均陽(yáng)性率為2.53%，其中山羊陽(yáng)性率較高為17.04%，綿羊陽(yáng)性率為1.77%[9]。新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所于2012年再次對(duì)新疆8個(gè)地州的8個(gè)縣市進(jìn)行藍(lán)舌病調(diào)查，羊血清BTV檢出率為1.32%，其中尉犁縣陽(yáng)性率最高為 3.33%[7]，證明藍(lán)舌病在新疆長(zhǎng)期存在，且廣泛流行。 尉犁縣位于 N40°10′33″～41°39′17″，處于藍(lán)舌病流行的緯度帶上，從本研究對(duì)哨兵動(dòng)物群BTV抗體變化的結(jié)果來(lái)看，僅10月出現(xiàn)2份陽(yáng)性樣品，這可能與當(dāng)?shù)貧夂蛴嘘P(guān)。

由于BTV的存活時(shí)間在血清中較長(zhǎng)而在動(dòng)物體內(nèi)較短，通常是動(dòng)物感染BTV轉(zhuǎn)陽(yáng)前、后1～2周可以分離到病毒，超過(guò)2周就無(wú)法分離到病毒。本研究在監(jiān)測(cè)哨兵動(dòng)物群的BTV轉(zhuǎn)陽(yáng)情況的同時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)陽(yáng)前、后1～2周的樣品進(jìn)行了病毒的分離，成功分類到了14株羊源藍(lán)舌病毒，14株病毒除1株為從綿羊分離到的外，剩下的都為山羊身上分離到的毒株，說(shuō)明分離到的藍(lán)舌病毒可能對(duì)山羊有較強(qiáng)的感染性，后續(xù)還需對(duì)分離到的藍(lán)舌病毒進(jìn)行進(jìn)一步的分型研究和鑒定。

本研究通過(guò)設(shè)置哨兵動(dòng)物群，監(jiān)測(cè)抗體變化并進(jìn)行細(xì)胞分毒，最后成功分離到14株羊源性BTV，所分離到的藍(lán)舌病毒毒株還需進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定及測(cè)序，進(jìn)一步的分析血清型是否與已發(fā)現(xiàn)的血清型一致，為繼續(xù)調(diào)查研究新疆BTV病原及其流行特征提供科學(xué)依據(jù)。

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