蔣 安 楊 衛(wèi) 黃德均 高立芳 張 健 向白菊**

（1 重慶市畜牧科學(xué)院 重慶 400015 2 重慶市璧山區(qū)河邊畜牧獸醫(yī)站 重慶 402760）

細(xì)胞生成過(guò)程取決于2 種或多種蛋白質(zhì)與大分子復(fù)合物的可逆和特異性結(jié)合。這種蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成可以是暫時(shí)的，也有形成后長(zhǎng)期處于穩(wěn)定狀態(tài)的，其功能主要是參與細(xì)胞中DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)和代謝等過(guò)程［1］。目前信號(hào)傳導(dǎo)途徑中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用已經(jīng)得到廣泛深入的研究，但對(duì)于初級(jí)或次級(jí)代謝途徑中多酶復(fù)合物形成的分子機(jī)制的研究還相對(duì)較少。在初級(jí)代謝中，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用可通過(guò)特定途徑形成最佳數(shù)量的多蛋白復(fù)合物。復(fù)合物中反應(yīng)底物的代謝通道位于不同酶活性位點(diǎn)之間，在大分子組裝形成時(shí)具有較大優(yōu)勢(shì)，不僅如此，復(fù)合物中各種酶的相互作用也都具有重要的調(diào)節(jié)功能，例如在植物和細(xì)菌的半胱氨酸（cystaine Cys）生物合成途徑中發(fā)生的多酶復(fù)合體現(xiàn)象即如此［2］。

存在于微生物和植物細(xì)胞中的半胱氨酸合成酶（cystaine synthase EC 4.2.99.8），大小約為60～70 kda，是一個(gè)同源二聚體［3］。它也被稱(chēng)為O-乙酰絲氨酸硫解酶［O-acetylserine （thiol） lyase OASTL］。OASTL 的功能是以2 分子的5′-磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate PLP）作為輔助因子，催化O-乙酰絲氨酸（O-acetylserine OAS）和硫化氫合成半胱氨酸（Cys），這個(gè)反應(yīng)過(guò)程如圖1所示。這是自然界中的無(wú)機(jī)硫摻入到Cys 的最后一步反應(yīng)，通過(guò)這個(gè)反應(yīng)無(wú)機(jī)硫可以轉(zhuǎn)化為有機(jī)硫。但生物對(duì)無(wú)機(jī)硫的吸收利用遠(yuǎn)非如此簡(jiǎn)單，例如植物根系利用土壤中硫酸鹽需要?dú)v經(jīng)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、同化、分配等過(guò)程。這些代謝過(guò)程由半胱氨酸合成酶（OASTL）等一系列酶和蛋白質(zhì)參與和調(diào)節(jié)。在細(xì)菌中，無(wú)機(jī)硫也是通過(guò)此反應(yīng)摻入半胱氨酸，再由半胱氨酸轉(zhuǎn)化成其他含硫化合物，例如蛋氨酸和谷胱甘肽。而動(dòng)物體內(nèi)因?yàn)椴淮嬖贠ASTL，沒(méi)有這些代謝過(guò)程，更沒(méi)有將其轉(zhuǎn)化成有機(jī)硫的各種調(diào)節(jié)機(jī)制，所以動(dòng)物只能依靠吸收植物或微生物中的有機(jī)硫，才能滿足體內(nèi)對(duì)硫元素的需要，因此該反應(yīng)處于自然界硫循環(huán)過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，被認(rèn)為是關(guān)鍵反應(yīng)。

此外，由于從碳和氮的同化途徑中得到的OAS，是合成半胱氨酸的前體物質(zhì)，生成OAS 的反應(yīng)由絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（SAT，EC 2.3.1.30）催化，所以O(shè)ASTL 和SAT 不但是自然界中硫循環(huán)的關(guān)鍵酶，對(duì)于硫在其同化途徑中的流通來(lái)說(shuō)，OASTL 和SAT 的活性還具有更為特殊的意義，因?yàn)橥ㄟ^(guò)OAS 合成這個(gè)中間環(huán)節(jié)，OASTL 和SAT 將硫的同化途徑和氮、碳的同化途徑相聯(lián)系，并且能對(duì)這些途徑的平衡產(chǎn)生影響［5］。

1 OASTL 和SAT 復(fù)合體

植物和細(xì)菌中的OASTL 主要存在于細(xì)胞的胞質(zhì)、質(zhì)體和線粒體中，并有多種異形體。SAT 主要催化半胱氨酸的前體物質(zhì)OAS 的合成，它同樣也出現(xiàn)在細(xì)胞的胞質(zhì)、質(zhì)體和線粒體中。SAT 和OASTL 能通過(guò)相互作用形成CSC［6］，目前已查明，二者的相互作用在Cys 的合成調(diào)節(jié)中處于核心地位。Kredich［3］在研究鼠傷寒沙門(mén)氏菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中SAT 的濃度遠(yuǎn)低于OASTL，后者大約是前者的300 倍，說(shuō)明細(xì)胞中僅僅只有一小部分的OASTL和SAT 存在相互作用，形成了CSC。Wirtz 等［7］曾對(duì)CSC進(jìn)行過(guò)缺失作圖和雙雜交實(shí)驗(yàn)，以便更好地描述SAT-OASTL 復(fù)合體中結(jié)構(gòu)域的特性，但到目前為止，這個(gè)復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)圖還沒(méi)有人能夠制作出來(lái)。另一方面，盡管OASTL 二聚體的三維結(jié)構(gòu)圖已經(jīng)被Nakako 等［8］繪制完成，但由于這個(gè)復(fù)合體的表面相互作用極其復(fù)雜，目前仍不清楚OASTL結(jié)構(gòu)域中與SAT 產(chǎn)生相互作用的是哪部分序列，也就很難對(duì)其與SAT 產(chǎn)生相互作用的各個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行分析作圖［8］。迄今為止對(duì)這個(gè)復(fù)合體生物化學(xué)研究還僅能展現(xiàn)CSC 組裝形成過(guò)程中的局部視圖。

2 半胱氨酸合成酶復(fù)合體的組裝形成

之前的多個(gè)研究已經(jīng)表明植物和細(xì)菌的OASTL和SAT 之間存在相互作用，但關(guān)于來(lái)自植物或細(xì)菌的CSC 的組裝結(jié)構(gòu)的信息還很少，目前尚不清楚CSC 組裝形成的詳細(xì)分子基礎(chǔ)。Kredich等［3］使用超速離心機(jī)確定了從鼠傷寒沙門(mén)氏菌純化的CSC 的組合分子量為310，并提出它含有1個(gè)SAT 六聚體和2 個(gè)OASTL 二聚體。后來(lái)，體積排除色譜法研究揭示了植物CSC 具有相似的分子量，但提出了一個(gè)替代模型，其中同源四聚體SAT 和2 個(gè)OASTL 二聚體締合形成大分子組合。隨后，分別測(cè)定了來(lái)自細(xì)菌的SAT 和來(lái)自細(xì)菌和植物的OASTL［9］的X 射線晶體結(jié)構(gòu)。細(xì)菌SAT 似乎可以看作同源六聚體（單體Mr≈30-33），其中2 個(gè)三聚體頭對(duì)頭排列，每個(gè)三聚體的C 末端尾部在六聚體的相對(duì)端（圖2a區(qū)域）。在植物和細(xì)菌中，OASTL被組裝為同型二聚體蛋白（單體Mr≈35-38），每個(gè)單體活性位點(diǎn)帶有含吡哆醛磷酸鹽分子的席夫堿，其中的賴(lài)氨酸殘基具有催化作用（圖2b區(qū)域）。嘗試鑒別SAT-OASTL 相互作用位點(diǎn)的研究表明，SAT 的C 末端對(duì)于復(fù)合物形成是至關(guān)重要的，且SAT 的C 端區(qū)域也是活性位點(diǎn)的位置。通過(guò)研究細(xì)菌和植物OASTL 對(duì)應(yīng)于其同源SAT 的C 末端區(qū)域的肽復(fù)合位置的X 射線晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示OASTL 活性位點(diǎn)就是其與SAT 結(jié)合的位置［10］（圖2）。

在這一相互作用的過(guò)程中SAT 最大限度地結(jié)合2 個(gè)分子的OASTL，這被認(rèn)為涉及將C 末端從SAT 三聚體中的原體對(duì)接到OASTL 活性位點(diǎn)。這種相互作用使OASTL 催化失活，并防止其進(jìn)一步結(jié)合SAT 三聚體；因此，該系統(tǒng)顯示了接觸誘導(dǎo)可以導(dǎo)致每個(gè)生物大分子的一半失活。為了更好地了解CSC 形成的動(dòng)力學(xué)和能量學(xué)，Ting Wang（2012）等［12］在平衡和預(yù)穩(wěn)態(tài)下研究了OASTL 和SAT與大腸桿菌的相互作用。使用在CSC 形成反應(yīng)的不同點(diǎn)引發(fā)CSC 解離的實(shí)驗(yàn)策略，鑒定出3種穩(wěn)定形式的復(fù)合物，確定了2 個(gè)瞬時(shí)存在的中間體，其中一個(gè)來(lái)自嗜血桿菌流感的CSC［13］。將SAT 與其C 末端肽的結(jié)合進(jìn)行動(dòng)力學(xué)和能量學(xué)比較，結(jié)果支持了SAT 的C 端通過(guò)將CSC 蛋白質(zhì)復(fù)合物栓系在一起的非別構(gòu)相互作用附著于OASTL的機(jī)制。松散耦合的復(fù)合物接下來(lái)參與了至少2次在能量上更有優(yōu)勢(shì)的異構(gòu)化，產(chǎn)生處于最佳穩(wěn)定狀態(tài)的CSC 復(fù)合物并導(dǎo)致OASTL 的失活。

Julie A.Francois 等［14］更進(jìn)一步確定了擬南芥OASTL（At-OASTL）的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)擬南芥OASTL與對(duì)應(yīng)的SAT（C10 肽）的C 末端10 個(gè)殘基的肽結(jié)合。具體方式是與關(guān)鍵活性位點(diǎn)殘基（Thr-74，Ser-75 和Gln-147）的氫鍵相互作用，將C10 肽鎖定在結(jié)合位點(diǎn)。這種與C10 肽結(jié)合可以通過(guò)阻斷的方式獲得OASTL 催化殘留物，這說(shuō)明了復(fù)合物的形成是如何下調(diào)OASTL 活性的。將擬南芥OASTL 與細(xì)菌OASTL 比較表明，活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)可塑性允許SAT C 末端與結(jié)構(gòu)相似的OASTL 活性位點(diǎn)的不同序列結(jié)合。活性位點(diǎn)突變 （T74S，S75A，S75T 和Q147A）影響的量熱分析表明，這些殘基對(duì)于C10肽結(jié)合是重要的，并且在這些位置的變化破壞同源二聚體酶中活性位點(diǎn)之間的通信。

3 半胱氨酸合成酶復(fù)合體的調(diào)控機(jī)制

CSC的形成在調(diào)控這2 個(gè)酶的活性中起著重要的作用。由CSC 調(diào)節(jié)的硫同化和半胱氨酸生物合成之間的相互作用具有非常重要的意義，由于最終產(chǎn)物半胱氨酸是植物中所有含硫醇化合物的硫代謝來(lái)源，其合成代謝在硫醇代謝中具有中樞作用，并且可以影響多種細(xì)胞過(guò)程。Hell 等［15］提出了一個(gè)假說(shuō)，闡明了復(fù)合體形成的重要意義，其要點(diǎn)在于：1）當(dāng)細(xì)胞中有足夠的硫時(shí)，由于硫化物能使復(fù)合體穩(wěn)定，所以O(shè)ASTL 和SAT 結(jié)合。2）由于結(jié)合狀態(tài)下的OASTL 對(duì)OAS 的親和性很低，OAS 合成后就離開(kāi)復(fù)合體。3）OAS 被游離的OASTL 消耗生成半胱氨酸，大約5%的OASTL 形成復(fù)合體，而95%處于游離狀態(tài)。在硫缺乏時(shí)硫化物的量下降，OAS 累積到足以有效解離SAT 和OASTL 復(fù)合體的濃度。4）結(jié)果SAT 活性降低（降解或被修飾），同時(shí)，OAS 誘導(dǎo)負(fù)責(zé)硫的吸收和同化的基因解除被抑制的狀態(tài)。5）這是個(gè)可逆的系統(tǒng)，因?yàn)檫M(jìn)入細(xì)胞的硫酸鹽被還原后，硫化物被摻合進(jìn)半胱氨酸，這步反應(yīng)由游離的OASTL 催化，并利用了累積的OAS作為底物，這樣就降低了OAS 的水平，從而促進(jìn)了復(fù)合體的形成。6）同時(shí)也可看到SAT（至少其胞質(zhì)形式）的活性受到L-半胱氨酸反饋抑制。

這個(gè)假說(shuō)對(duì)于闡明復(fù)合體形成及其對(duì)硫吸收途徑調(diào)節(jié)的影響有很大幫助。具有活性的OASTL并不在復(fù)合體當(dāng)中，而是處于游離狀態(tài)，當(dāng)其與SAT 形成復(fù)合體后，則通過(guò)變構(gòu)效應(yīng)而失去活性。有趣的是，SAT 只有在復(fù)合體當(dāng)中才具有活性，而處于游離狀態(tài)時(shí)則沒(méi)有活性［16］。當(dāng)細(xì)胞中的硫充足時(shí)，游離的OASTL 將OAS 轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，并使半胱氨酸過(guò)量存在。大約有5%的OASTL 參與形成復(fù)合體，其他95%的OASTL 則處于游離狀態(tài)。最近獲得的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，為CSC 作為細(xì)胞中硫在初級(jí)代謝中流通調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)的作用提供了證據(jù)［17］，同時(shí)也表明硫化物能誘導(dǎo)CSC 的形成，而OSA 則促使復(fù)合體解離。所以，在硫缺乏時(shí)，硫化物的量下降，OAS 就會(huì)累積到足以有效解離SAT 和OASTL 復(fù)合體的濃度，結(jié)果SAT 降解或被修飾，其活性就會(huì)降低。不但如此，OAS 誘導(dǎo)負(fù)責(zé)硫的吸收和同化的基因同時(shí)會(huì)解除被抑制的狀態(tài)。這個(gè)系統(tǒng)是可逆的，進(jìn)入細(xì)胞的硫酸鹽被還原后，硫化物就進(jìn)入了半胱氨酸，無(wú)機(jī)硫轉(zhuǎn)化成有機(jī)硫，游離的OASTL 在反應(yīng)中以累積的OAS 作為底物進(jìn)行催化反應(yīng)，利用并消耗了OAS，使其水平降低，這又促進(jìn)了OASTL 和SAT 的結(jié)合。同時(shí)，也可看到L-半胱氨酸對(duì)SAT（至少其胞質(zhì)形式）的活性進(jìn)行反饋抑制。

Sangaralingam 等［11］使用生物和物理方法的組合，研究了植物CSC 的組成，并提出了一種監(jiān)管大分子裝配體系結(jié)構(gòu)的新模型。穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析表明，CSC 形成增強(qiáng)SAT 活性，并通過(guò)生物合成途徑的最終產(chǎn)物半胱氨酸從底物抑制和反饋抑制中釋放SAT。半胱氨酸分別抑制SAT 和CSC，表明OASTL 和SAT 的相互作用是負(fù)合作的，并且2 種酶的結(jié)合減輕了SAT 活性對(duì)半胱氨酸生成的反饋抑制。該研究小組根據(jù)以前的報(bào)告和他們的分析數(shù)據(jù)，建議將OASTL 看作SAT 的酶伴侶。

3.1 重組植物CSC 的調(diào)控作用 多酶復(fù)合物在包括翻譯、轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種細(xì)胞過(guò)程中起核心作用。重組植物SAT 和OASTL 的生物化學(xué)分析表明，CSC 中蛋白質(zhì)的可逆結(jié)合控制細(xì)胞硫穩(wěn)態(tài)。SAT 和OASTLs 的轉(zhuǎn)錄本豐度，蛋白質(zhì)水平和可提取活性未被硫同化途徑的硫限制或遺傳操作顯著改變。然而，接觸有毒化合物或苛刻脅迫處理可以誘導(dǎo)擬南芥中特定SAT 和OASTL同種型的顯著轉(zhuǎn)錄。這就提供了基于對(duì)自由存在的SAT 的動(dòng)力學(xué)研究方法，其中SAT 活性主要通過(guò)SAT 的半胱氨酸反饋抑制在代謝水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)。隨后，Wirtz 等［18］提出了基于SAT 和OASTL在異寡聚半胱氨酸合成酶復(fù)合物中的可逆相互作用的SAT 活性的調(diào)節(jié)模型。

3.2 CSC 在亞細(xì)胞中的分布及線粒體CSC（mCSC）的調(diào)控 CSC 雖然同時(shí)存在于植物細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)、質(zhì)體和線粒體中，但SAT 和OASTL 的活性和量在這些亞細(xì)胞間隔之間有顯著的差異。在擬南芥葉中，OASTL 活性的90%由OASTLA 在胞質(zhì)溶膠中提供，OASTLB 在葉綠體中提供，其余活性來(lái)自線粒體OASTL C［19］。相比之下，發(fā)現(xiàn)總SAT 活性的80%來(lái)源于線粒體同工型SAT3（serat2；2）。殘留SAT 活性由質(zhì)體局部化的SAT1（serat2；1）和3 個(gè)胞質(zhì)SAT，其中SAT5（serat1；1）是最豐富的。每個(gè)SAT 基因的T-DNA 插入突變體是可行的，證明在細(xì)胞溶質(zhì)、質(zhì)體或線粒體中單獨(dú)的OAS 合成不是必需的。線粒體SAT3 的敲除引起顯著的生長(zhǎng)遲緩，這表明線粒體在供應(yīng)OAS 用于半胱氨酸合成中的主要作用。mCSC 在調(diào)節(jié)SAT3 活性和細(xì)胞半胱氨酸中的突出作用也由oastl-C 的生長(zhǎng)遲緩表型展現(xiàn)出來(lái)，而oastl-A 和oastl-B 突變體則不受影響。然而，體外CSC 形成對(duì)絲氨酸和乙酰輔酶A 的SAT3 親和力影響不大，但與游離SAT3 相比，CSC 結(jié)合的SAT3 對(duì)半胱氨酸的反饋抑制敏感性較低。

3.3 CSC 對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝調(diào)節(jié)的影響 在代謝方面，OASTL 以多種方式作為SAT 的酶伴侶。不僅CSC 的形成增加了OAS 合成速率，SAT 和OASTL的關(guān)聯(lián)將半胱氨酸生物合成的限制步驟從反饋抑制中釋放出來(lái)。植物中的生理半胱氨酸水平范圍為10～20 μm。CSC 的快速和穩(wěn)定的形成將允許在高需求條件例如環(huán)境氧化應(yīng)激下產(chǎn)生OAS 以維持細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸水平。在低硫狀態(tài)條件下，復(fù)合物的解離通過(guò)反饋調(diào)節(jié)恢復(fù)SAT 的調(diào)節(jié)。有趣的是，CSC 的形成也可能增加SAT 的物理穩(wěn)定性。在大腸桿菌中，與OASTL 的結(jié)合可防止SAT 的冷滅活。不清楚這是否也發(fā)生在諸如大豆之類(lèi)的植物中，其中硫同化和半胱氨酸生產(chǎn)在低溫冷卻時(shí)需求會(huì)增加［20］。最終，植物中的半胱氨酸生物合成和硫醇代謝在蛋白質(zhì)水平上通過(guò)多種分子機(jī)制（包括復(fù)合物形成，氧化還原調(diào)節(jié)和磷酸化）被高度調(diào)節(jié)，以整合調(diào)節(jié)酶活性的多種細(xì)胞信號(hào)以滿足代謝物供應(yīng)的各種需求。