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(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 貴陽 550025; 2.貴州大學(xué)園藝專業(yè)學(xué)科實驗室, 貴陽 550025; 3.貴州省茶葉研究所, 貴陽 550025; 4.都勻市科技和知識產(chǎn)權(quán)局, 貴州 都勻 558000; 5.遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院, 貴州 遵義 563000; 6.國家茶及茶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(貴州), 貴州 遵義 563000; 7.貴州大學(xué)茶學(xué)院, 貴陽 550025)

古茶樹是遺傳多樣性最豐富、最具有保存和研究價值的初級茶樹種質(zhì)資源[1]。古茶樹資源中富含的許多特異性狀，如高茶多酚、低咖啡堿、高茶氨酸、高抗性基因源、茶黃素形成能力強(qiáng)等可以直接利用[2-4]。古茶樹作為茶樹育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，是繁育新品種的原始材料，是種質(zhì)資源的重要組成部分，是茶學(xué)領(lǐng)域研究的基礎(chǔ)[5]。

茶葉中的氨基酸是茶葉品質(zhì)的重要組成部分[6]，決定茶湯滋味，與茶葉的品質(zhì)有一定的相關(guān)性，同時又是人體所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，對人體疾病的預(yù)防和康復(fù)起著極為重要的作用。茶葉中氨基酸的組成、含量及其降解產(chǎn)物和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的含量變化將直接影響到茶葉的品質(zhì)、香氣和滋味，因此，測定古茶樹中氨基酸的含量和種類對古茶樹的開發(fā)利用具有重要的意義。

植物中氨基酸的測定方法主要有甲醛滴定法[7]、凱氏定氮法[8]、分光光度法[9]、色譜法(主要有：氣相色譜法[10]、液相色譜法[11-12]、毛細(xì)管電泳色譜法[13])、電化學(xué)法[14]等。高效液相色譜法簡便、快速、靈敏，可以對茶葉中氨基酸進(jìn)行定性和定量測定，是目前較常用的方法[15]。本研究以來自貴州不同地區(qū)的4個古茶樹優(yōu)系為材料，研究高效液相色譜法(HPLC)測定古茶樹氨基酸的色譜條件，并分析4個古茶樹氨基酸組分和含量，以確定一種適用于古茶樹氨基酸測定的高效液相色譜法，為合理開發(fā)利用古茶樹提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

供試材料為貴州大學(xué)茶學(xué)實驗基地的古茶2號、古茶4號、古茶6號及古茶8號的4年生扦插茶樹春梢1芽2葉，以種植在茶學(xué)實驗基地的福鼎大白茶春梢1芽2葉作為對照(詳見表1)。

表1 供試材料

編號來源2遵義市正安縣4黔南州貴定縣6黔西南州興義市8黔西南州普安縣福鼎大白茶(ck)貴陽花溪

主要試劑有氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(該標(biāo)準(zhǔn)品購買于SK Chemicals)：組氨酸(L-His)、甘氨酸(L-Gly)、茶氨酸(L-Thea)、精氨酸(L-Arg)、半胱氨酸(L-Cys)、絲氨酸(L-Ser)、脯氨酸(L-Pro)、纈氨酸(L-Val)、亮氨酸(L-Leu)、丙氨酸(L-Ala)、蘇氨酸(L-Thr)、賴氨酸(L-Lys)、谷氨酸(L-GLu)、天冬氨酸(L-Asp)、苯丙氨酸(L-Phe)、絡(luò)氨酸(L-Tyr)、甲硫氨酸(L-Met)、異亮氨酸(L-Ile)。

色譜純：乙腈、苯異硫氰酸酯。

分析純：無水乙醇、三乙胺、鹽酸。

1.2 儀器與設(shè)備

主要儀器與設(shè)備為濾紙、漏斗、玻璃棒、鐵架臺、燒杯、容量瓶、微波爐、水浴鍋、三角瓶、分光光度計、分析天平、電熱恒溫水浴鍋、高效液相色譜儀、超純水儀、漩渦混合器、移液槍、手動進(jìn)樣器、烘箱等。

1.3 試驗方法

1.3.1 材料處理方法

3月中旬于貴州大學(xué)茶學(xué)實驗基地采摘試驗材料，采摘標(biāo)準(zhǔn)為1芽2葉，采摘后的每一個鮮葉材料用隨機(jī)取樣法抽取10個芽頭，并把每個材料在250 ℃左右殺青、干燥40 min后于烘箱中103 ℃烘干，密封冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 測定方法

采用103 ℃恒重法測定水分[14]，游離氨基酸總量采用茚三酮比色法[15]，游離氨基酸的定量定性分析采用高效液相色譜法[16]。

1.3.3 試劑配制

1) 混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

準(zhǔn)確稱取天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、酪氨酸、擷氨酸、甲硫氨酸、半膚氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、賴氨酸各0.200 0 g，用0.02 mol/L HCl溶解并定容至500 mL。配制成每種氨基酸含量為0.400 0 mg/mL的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，放入4 ℃冰箱保存。

2) 衍生試劑的配制[16]。

用超純水、三乙胺(TEA)、異硫氰酸苯酯(PITC)、無水乙醇，按體積比1∶1∶1∶7的比例配制10 mL(使用前臨時配制)。

3) pH=6.77硼酸緩沖液的配置。

A液：取硼酸1.236 8 g，氯化鈉0.292 5 g混合后加水溶解，并定容至100 mL。

B液：取硼酸鈉1.90 7 g，加水溶解并定容至100 mL。

取A液97 mL，B液3 mL混合后即為pH為6.77的硼酸緩沖液。

4) 18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)液的配制。

準(zhǔn)確稱取0.015，0.025，0.035，0.045，0.055，0.065 g氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品至50 mL容量瓶，用0.02 mol/L鹽酸定容，配置成0.3，0.5，0.7，0.9，1.1，1.3 g/L的氨基酸標(biāo)樣儲備液。分別移取10μL氨基酸標(biāo)樣儲備液于離心管中，加入20μL衍生液和70μL硼酸緩沖液，渦旋混合10 s，靜置1 min后于55 ℃下加熱10 min，吸取10μL上機(jī)分析。

5) 供試樣品溶液配制。

精確稱取0.3 g(精確至0.001 g)茶葉試樣于50 mL帶塞的三角錐形瓶中，加入0.02 mol/L HCl，立即將錐形瓶移入沸水浴中，浸提45 min，每隔10 min搖動錐形瓶1次，浸提完畢后用脫脂棉趁熱過濾，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用少量熱蒸餾水將殘渣洗滌2～3次，所得濾液一起并入上述50 mL容量瓶中，待濾液冷卻后用0.02 mol/L HCl溶解定容、混勻，0.45μm水系微孔濾膜過濾，待衍生化。

表2 不同流動相處理

處理流動相A流動相B檢測波長(nm)流速為(mL/min)柱溫(℃)進(jìn)樣量(μL)處理1乙腈超純水2541.04010處理2甲醇超純水2541.04010處理3乙腈甲醇2541.04010處理4乙腈∶水=1∶3甲醇2541.04010處理50.1mol/L無水醋酸鈉∶乙腈=93∶7乙腈∶水=8∶22541.04010

圖1 超純水與0.2 mol/L HCl溶解谷氨酸色譜圖

6) 衍生化過程。

分別準(zhǔn)確吸取對照品和供試樣品溶液各10μL離心管中，加入20μL衍生液和70μL硼酸緩沖液，渦旋混合10 s，靜置1 min后于55 ℃下加熱10 min，吸取10μL上機(jī)分析。

1.4 色譜條件及流動相

1.4.1 色譜系統(tǒng)

高效液相色譜儀：日本島津公司的LC-20 A HPLC

色譜工作站：日本島津公司的LC-20 A的色譜工作站

分析色譜柱：日本島津公司C 18柱。

1.4.2 溶劑的選擇

準(zhǔn)確稱取0.02 g谷氨酸2份，一份用超純水溶解并定容至50 mL；另一份用0.2 mol/L HCl溶解定容至50 mL，然后以PITC作為衍生試劑進(jìn)行衍生反應(yīng)，選擇流動相A：0.1 m無水醋酸鈉(用冰醋酸調(diào)節(jié)其pH=6.5)∶乙腈=93∶7；流動相B：乙腈∶超純水=8∶2；進(jìn)行梯度洗脫。

1.4.3 流動相的篩選

試驗采用0.2 mol/L的鹽酸作為溶劑，用谷氨酸作為檢測物質(zhì)，高效液相色譜儀測定古茶樹氨基酸含量的條件為檢測器檢測波長254 nm，色譜柱流速為1.0 mL/min，柱溫是40 ℃，以強(qiáng)度和對稱性作為選擇指標(biāo)以確定檢測氨基酸的適宜流動相。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行常規(guī)整理，運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑的選擇

由圖1可知，超純水溶解色譜圖的強(qiáng)度為8.5，并且對稱性不好；鹽酸溶解色譜圖的強(qiáng)度為57，且對稱性好。根據(jù)出峰強(qiáng)度和對稱性，選擇0.2 mol/L HCl作為氨基酸的溶劑。

2.2 流動相的選擇

由圖2可知，5個流動相處理下出峰強(qiáng)度最大為流動相處理5，達(dá)110，且5個流動相處理下流動相處理5的峰對稱性比其他4個處理好，流動相處理5在出峰前沒有下凹的跡象，在出峰的整個過程中沒有出現(xiàn)雙峰。因此，選取最佳的流動相為流動相A:0.1 mol/L無水醋酸鈉(pH=6.5)∶乙腈=93∶7，流動相B:乙腈∶水=8∶2。

2.3 18種氨基酸混合標(biāo)樣色譜圖分析

從圖3可以看出，18種氨基酸混合標(biāo)樣各組分之間的分離良好，分離效果滿意。而且各組分的峰型也呈現(xiàn)出良好的對稱性。分析周期為60 min，但是在30 min時18種氨基酸已經(jīng)完全分離出來。從圖形上看，該方法能夠較好地分離氨基酸組分，色譜圖形較好，在保證分離效果的同時，實現(xiàn)了較快分析的目的。

圖2 不同流動相對谷氨酸峰值和對稱性的影響

圖3 18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

表3 18種氨基酸混合標(biāo)樣出峰順序及出峰時間表

出峰順序 氨基酸名稱出峰時間(min)1 半胱氨酸3.362 天冬氨酸3.833 谷氨酸4.114 絲氨酸7.495 甘氨酸8.176 組氨酸9.247 精氨酸11.308 丙氨酸11.889 脯氨酸12.7010 茶氨酸17.8011 絡(luò)氨酸20.2912 纈氨酸21.6113 甲硫氨酸22.5314 蘇氨酸24.7015 異亮氨酸25.0516 亮氨酸25.5017 苯丙氨酸27.5018 賴氨酸29.63

2.4 18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線表

由表4可知，相關(guān)系數(shù)在0.995 8～0.999 9之間，表明線性關(guān)系良好，該方法滿足氨基酸定量分析的要求。

表4 18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線表

編號 氨基酸 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程相關(guān)系數(shù)R1半胱氨酸y=154095x-27130.99982天冬氨酸y=54060x-16530.99973谷氨酸y=664225x-33020.99924絲氨酸y=208940x-3670.99985甘氨酸y=112424x-11060.99986組氨酸y=372677.5x-6260.99997精氨酸y=174145x-16490.99588丙氨酸y=79502x-13570.99989脯氨酸y=82207x-9350.999710茶氨酸y=46732x-14810.999811酪氨酸y=62005x-16420.999912纈氨酸y=116912.5x-9610.999313甲硫氨酸y=9021.5x-15930.999414蘇氨酸y=210917.5x-2720.998615異亮氨酸y=168177.5x-7700.999716亮氨酸y=256710x-6760.999717苯丙氨酸y=113555x-11750.999918賴氨酸y=584532x-16160.9993

注：y為色譜圖的峰面積，x為氨基酸濃度。

2.5 4個古茶樹春梢游離氨基酸含量分析

由表5可知，各古茶樹的游離氨基酸總量均高于ck，4個古茶樹氨基酸含量以6號最高，8號古茶樹最低。

從茶葉樣品中氨基酸的含量上看，不同茶樣之間的氨基酸組分含量有一定規(guī)律。在所測定的18種氨基酸中，茶氨酸的含量最高；而古茶樹6號的茶氨酸含量在4個古茶樹優(yōu)系中最高，且4個古茶樹優(yōu)系的茶氨酸均高于對照；對照的茶氨酸含量占總游離氨基酸含量的45.9%，8號古茶樹占52.2%、古茶樹4號53.3%、古茶樹2號43.8%、古茶樹6號49.1%。

表5 檢測茶樣中游離氨基酸的含量(mg/g)

福鼎大白茶(ck)茶樣8茶樣4茶樣2茶樣6半胱氨酸0.9180.3450.8621.0682.067天冬氨酸0.4280.3180.460.5330.618谷氨酸0.0340.0340.0550.0040.057絲氨酸0.2570.0110.1070.080.086甘氨酸0.0210.2680.1950.0990.096組氨酸0.0110.0530.0580.0070.034精氨酸0.1380.0580.1280.0350.144丙氨酸0.2710.0620.0560.1460.153脯氨酸0.3180.0510.0950.2290.249茶氨酸4.8026.0786.6845.8727.916酪氨酸1.5081.7012.4790.7241.852纈氨酸0.0560.0220.1970.08671.655甲硫氨酸1.3741.9980.7983.2331.264蘇氨酸0.0150.0630.0580.0460.053異亮氨酸0.1070.0350.0490.1770.135亮氨酸0.0270.030.0210.1290.035苯丙氨酸0.0560.5010.0960.1290.025賴氨酸0.1070.0120.1280.0260.149總量10.45311.6412.52613.40416.138

3 結(jié)論與討論

本實驗采取HPLC法定量分析貴州大學(xué)教學(xué)實驗茶園的2號、4號、6號、8號古茶樹優(yōu)系的游離氨基酸含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，古茶樹2號、4號、6號、8號的游離氨基酸含量和茶氨酸含量均高于對照福鼎大白，茶氨酸含量占茶葉干重5%以上，含量超過大部分茶葉茶氨酸含量[17]。茶氨酸古茶6號的游離氨基酸和茶氨酸含量最高；其中，古茶4號的茶氨酸含量占總游離氨基酸含量的53.3%，是4個古茶樹優(yōu)系中茶氨酸含量占比最高的，且高于對照福鼎大白茶，這符合茶氨酸是茶葉中含量最高的游離氨基酸的觀點(diǎn)[18]。本研究在測定過程中，根據(jù)篩選出的溶劑以及色譜條件，以出峰的最大強(qiáng)度和對稱性為依據(jù)，選擇出最適合的流動相為檢測器檢測波長254 nm；色譜柱流速為1.0 mL/min， 柱溫為40 ℃；流動相A為0.1 m無水醋酸鈉∶乙腈=93∶7，流動相B為乙腈∶水=8∶2。而張健等研究表明，采用C 18色譜柱，以甲醇和0.05%體積分?jǐn)?shù)的三氟乙酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，紫外檢測波長為208 nm，柱溫30 ℃效果最佳[19]，這可能是不同條件配合的結(jié)果。

本研究通過優(yōu)化流動相的方法，建立了一種快速分析古茶樹優(yōu)系氨基酸種類及含量的HPLC檢測體系，該檢測方法簡便、快速，具有較好的應(yīng)用前景。

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