李 潔，王建福，馬玲玲，邱國斌，劉 珽

（甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070）

鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）等鄰苯二甲酸酯類（PAEs）是塑料工業(yè)使用最廣泛、品類最多、產(chǎn)量最大的增塑劑，在塑料、建筑材料、服裝、化妝品、醫(yī)藥品、食品包裝材料乃至兒童玩具中均有使用［1］。DMP與多種樹脂都有很強的溶解力，可與多種纖維素樹脂、橡膠、乙烯基樹脂相溶，有良好的成膜性、粘著性和防水性［2］。同時，DMP還可用作驅蚊油（原油）、聚氟乙烯涂料、過氧化甲乙酮等的溶劑。伴隨塑料制品的生產(chǎn)、使用和廢棄，DMP可不斷地釋放出來，進入環(huán)境和生物體，造成潛在的危害。美國國家環(huán)境保護局列出6種PAEs類化合物作為重點污染物，DMP位列之首，DMP等鄰苯二甲酸酯類也被列為中國環(huán)境水中優(yōu)先控制污染物黑名單［3］。劉慧杰等［4］、胡曉宇等［5］研究表明，PAEs具有內(nèi)分泌干擾效應，對生物生長發(fā)育具有一定毒性。周科等［6］研究發(fā)現(xiàn)，DMP對鯉魚肝細胞造成了一定的損傷，肝臟合成酶也隨之受到影響。但DMP對果蠅生殖功能和遺傳突變的報道較少。果蠅是真核多細胞生物，也是一種經(jīng)典模式生物，作為試驗動物，具有飼養(yǎng)容易、生存周期短、繁殖能力強和反應靈敏等特點，其代謝系統(tǒng)、生理功能和生長發(fā)育同哺乳動物有許多相似之處。在25℃左右10 d即可繁殖1代，1只雌性果蠅1次能繁殖近百只，可在較短時間得出結論。我們從果蠅蛹化率、羽化率、產(chǎn)卵時間、蛹化時間、羽化時間和果蠅繁殖數(shù)量6個方面探討了DMP對果蠅生長發(fā)育和繁殖的影響，以期對評估塑料污染和含PAEs材料制品對人類健康的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試動物

試驗指示動物為甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院遺傳實驗室提供的黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）。

1.2 試驗材料及設備

1.2.1 材料 玉米粉、白砂糖、瓊脂（天津市致遠化學試劑有限公司）、酵母浸粉（北京奧博星生物技術有限責任公司）、丙酸（天津市凱信化工業(yè)有限公司）、鄰苯二甲酸二甲酯（分析純，天津市光復精細化工研究所）、蔗糖脂肪酸酯（乳化劑，食品級，柳州愛格富食品科技股份有限公司）、乙醚。

1.2.2 設備 RXZ型智能人工氣候箱（寧波市儀器廠制造）、XH-B型漩渦混勻器（姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司）、YXQ-LS-SH全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器（上海博訊試業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）、電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、移液器（TopPette）、萬用電爐（北京永興儀器有限公司）、體視顯微鏡（Motic，廈門麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）、培養(yǎng)瓶（30mL）、燒杯（50、100、1 000 mL）、麻醉瓶、撥針、玻璃棒、記號筆。

1.3 實驗方法

試驗于2016年6—12月在甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院動物遺傳育種與繁殖實驗室完成。

基本培養(yǎng)基配制：將玉米粉56 g、白砂糖44 g、瓊脂粉5 g溶解于150 mL蒸餾水并攪拌均勻，然后用電爐邊加熱邊攪拌至煮沸呈粘稠狀，冷卻5 min后加入酵母粉5 g、丙酸3 mL，邊攪拌邊裝瓶，每瓶培養(yǎng)基厚度為0.5～1.0 cm。1份基本培養(yǎng)基分裝12～15瓶。

染毒培養(yǎng)基配制：用移液器量取0、0.1、0.5、2.5、7.5 mL DMP標準液，分別添加到100 mL乳化劑（含2%蔗糖脂肪酸酯）中稀釋，并用漩渦混勻器充分混勻，配成質量分數(shù)為0、0.1%、0.5%、2.5%、7.5%的DMP應用液。將不同質量分數(shù)的DMP應用液加入基本培養(yǎng)基并攪拌均勻，裝入培養(yǎng)瓶中，每瓶培養(yǎng)基厚度為0.5～1.0 cm，制成DMP質量分數(shù)分別為0、0.1%、0.5%、2.5%、7.5%的染毒培養(yǎng)基。以基本培養(yǎng)基作為對照組，每組均設5個重復。

1.4 測定方法

1.4.1 蛹化和羽化測定 將未交配的雌雄黑腹果蠅放入基本培養(yǎng)基中使其交配產(chǎn)卵12 h，然后將成蟲倒出。把含有卵的培養(yǎng)基放入智能人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，在12 h內(nèi)收集一齡幼蟲并放到含有不同濃度組的DMP染毒培養(yǎng)基中飼喂，每個培養(yǎng)瓶中放一齡幼蟲20只。從放入一齡幼蟲到培養(yǎng)基中出現(xiàn)蛹化時計時，每2 h觀察記錄蛹化時間及蛹化數(shù)。蛹化全部完成后每2 h觀察并記錄羽化時間，記錄新產(chǎn)生的羽化數(shù)，直至成蠅不再出現(xiàn)。

1.4.2 產(chǎn)卵時間測定 取未交配的黑腹果蠅50只，雌雄各半。用乙醚淺度麻醉后隨機配對25組，分別放入DMP質量分數(shù)分別為0、0.1%、0.5%、2.5%、7.5%的培養(yǎng)基中飼喂，每個質量分數(shù)梯度設置5組平行培養(yǎng)基，每瓶有1雌1雄共2只果蠅，觀察其生長情況。從放入未交配的果蠅開始計時，每2 h觀察記錄1次，瓶壁上出現(xiàn)約0.5 mm的橢圓形白色小點則表明開始產(chǎn)卵，從計時到開始產(chǎn)卵的時間段為產(chǎn)卵時間。每對果蠅培養(yǎng)7 d后，轉移至含相同培養(yǎng)基的果蠅瓶（新瓶）中培養(yǎng)，依照以上步驟培養(yǎng)3次。

1.4.3 繁殖量測定 隨機挑選飼喂基本培養(yǎng)基上的未交配果蠅，雌雄各半，放到不同質量分數(shù)的DMP染毒培養(yǎng)基上飼喂，每1質量分數(shù)梯度設置5瓶重復，每瓶有1雌1雄共2只作為親本。每對親本果蠅培養(yǎng)7 d后，轉移至含相同質量分數(shù)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（新瓶）中培養(yǎng)，移除親本后的培養(yǎng)瓶（原瓶）繼續(xù)培養(yǎng)。7 d后移除親本的培養(yǎng)瓶（原瓶）中出現(xiàn)的F1代果蠅，連續(xù)7 d統(tǒng)計羽化數(shù)量，計為其1期繁殖數(shù)量。轉移至新培養(yǎng)瓶（新瓶）繼續(xù)培養(yǎng)親本，在新瓶中培養(yǎng)7 d后做同上處理，計為第2期繁殖數(shù)量。重復以上步驟，統(tǒng)計第3期繁殖數(shù)量（以7 d記錄為1個周期，共研究3個周期即 21 d）。

2 結果與分析

2.1 DMP對黑腹果蠅生長發(fā)育的影響

從表1可以看出，隨著DMP質量分數(shù)的增加，黑腹果蠅的蛹化數(shù)呈先增加后降低的趨勢，但2.5%以下的DMP質量分數(shù)組差異并不顯著（P＞0.05），DMP質量分數(shù)為7.5%組的蛹化數(shù)顯著低于0.1%質量分數(shù)組（P＜0.05）。隨著DMP質量分數(shù)的增加，黑腹果蠅的羽化數(shù)有逐漸下降的趨勢，但2.5%以下的DMP質量分數(shù)組差異并不顯著（P＞0.05），7.5%組的羽化數(shù)顯著低于對照組和0.1%組（P＜0.05）。

表1 不同質量分數(shù)DMP對黑腹果蠅一齡幼蟲蛹化和羽化的影響①

2.2 DMP對黑腹果蠅繁殖的影響

2.2.1 DMP對黑腹果蠅產(chǎn)卵時間的影響 由表2可以看出，3期黑腹果蠅的平均產(chǎn)卵時間均在DMP質量分數(shù)為7.5%時最遲。第1期平均產(chǎn)卵時間在0.1%時最早，與除2.5%組以外的其他各組差異顯著（P＜0.05），對照組與0.5%、2.5%、7.5%組的產(chǎn)卵時間無顯著差異（P＞0.05）；第2期平均產(chǎn)卵時間在DMP質量分數(shù)0.1%時最早，與除對照組以外的其他各組差異顯著（P＜0.05），0.5%組的產(chǎn)卵時間顯著遲于0.1%組和對照組（P＜0.05），同時也顯著早于7.5%組（P＜0.05），但與2.5%組差異不顯著（P＞0.05）；第3期平均產(chǎn)卵時間在DMP質量分數(shù)為2.5%時最早，但其與除7.5%組之外的其他各組差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 不同質量分數(shù)DMP處理黑腹果蠅的平均產(chǎn)卵時間 d

2.2.2 DMP對黑腹果蠅繁殖數(shù)的影響 從表3可以看出，3期黑腹果蠅的平均繁殖數(shù)均表現(xiàn)出隨著DMP質量分數(shù)的增加而先增加后降低的趨勢。第1期平均繁殖數(shù)在DMP質量分數(shù)為0.5%時最高，顯著高于除0.1%組以外的其他各組（P＜0.05）；7.5%組的平均繁殖數(shù)最低，顯著低于其他各組（P＜0.05）。第2期平均繁殖數(shù)在DMP質量分數(shù)為0.5%時最高，顯著高于除0.1%組以外的其他各組（P＜0.05）；7.5%組的平均繁殖數(shù)最低，顯著低于其他各組（P＜0.05）。第3期平均繁殖數(shù)在DMP質量分數(shù)為0.5%時最高，顯著高于其他各組（P＜0.05）。從圖1可以看出，第2期繁殖的個體與正常果蠅對比形態(tài)發(fā)生了變化，有白體、殘翅和瘦小等癥狀（b、c左為正常），部分伴有畸形，如腹部彎曲、細尖，背部腫脹突起。據(jù)此推測DMP可能對果蠅的生長發(fā)育有致畸性的影響。

表3 不同質量分數(shù)DMP處理的黑腹果蠅繁殖數(shù) 只

3 結論與討論

鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）對黑腹果蠅的生長發(fā)育具有一定的抑制作用，高質量分數(shù)的抑制作用更為明顯。隨著鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）質量分數(shù)的增加，黑腹果蠅的繁殖性能表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。高質量分數(shù)的DMP可能對黑腹果蠅具有一定的致畸作用，但仍需進一步證實。

劉慧杰等［4］、胡曉宇等［5］的研究表明，鄰苯二甲酸酯類（PAEs）具有內(nèi)分泌干擾效應，對生物的生長發(fā)育具有一定的毒性。另外，有研究表明，鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）對細菌、藻類和馬鈴薯的生長均有明顯的抑制作用，隨著質量分數(shù)的升高其抑制作用隨之增強［7-10］。隨著DMP質量分數(shù)的升高，馬鈴薯可溶性蛋白含量呈下降趨勢，使馬鈴薯的生長受阻。鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）也可使細菌的形態(tài)發(fā)生變化，對菌體變長的影響與本文對果蠅形態(tài)的研究結論相似。

圖1 第2期黑腹果蠅繁殖個體比較

用不同質量分數(shù)鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）處理后的培養(yǎng)基飼喂的黑腹果蠅，其蛹化數(shù)和羽化數(shù)表現(xiàn)出降低的趨勢，尤其在7.5%的高質量分數(shù)組下降明顯，可見鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）對黑腹果蠅的生長發(fā)育具有抑制效應，且高質量分數(shù)組的抑制效應更明顯。高質量分數(shù)的鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）對黑腹果蠅產(chǎn)卵時間有明顯的延遲作用，而低質量分數(shù)組則影響較小。隨著鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）質量分數(shù)的升高，本試驗中黑腹果蠅繁殖數(shù)量先升高后降低，這與藺琰東等［10］馬鈴薯組培苗SOD活性呈升后降的變化趨勢的結論一致。隨著飼喂培養(yǎng)基鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）質量分數(shù)的升高，0.1%組和0.5%組與對照組相比，黑腹果蠅的繁殖數(shù)量逐漸增多；2.5%組和7.5%組與對照組相比黑腹果蠅的繁殖數(shù)逐漸減少，此結果與徐曼妮等［11］利用鄰苯二甲酸二丁酯處理果蠅的結果一致?？赡苁堑唾|量分數(shù)的鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）有促進黑腹果蠅繁殖的效應，而高質量分數(shù)的鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）又會抑制這種效應，其具體的影響機制還有待進一步從生理生化指標變化以及分子水平上做深入研究。從3期培養(yǎng)黑腹果蠅的繁殖數(shù)量上來看，第2期繁殖數(shù)量最多，第3期繁殖數(shù)量則明顯降低，可能與親本果蠅的老年化有關。在試驗觀察過程中還發(fā)現(xiàn)，第2期和3期培養(yǎng)的黑腹果蠅還出現(xiàn)了白體、殘翅和瘦小等異常癥狀的個體，部分個體還出現(xiàn)了腹部彎曲、細尖，背部腫脹突起等畸形，并且隨著DMP質量分數(shù)的增加，異常個體和畸形個體出現(xiàn)了增多的趨勢，推測高質量分數(shù)的鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）可能對黑腹果蠅有一定的致畸作用，但仍需要做進一步的驗證性研究。

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