劉為軍，張振勇，卿艷萍

(云南省第一人民醫(yī)院 肛腸科, 云南 昆明 650032)

胰腺癌是消化系統(tǒng)中高度惡性腫瘤，發(fā)病率位居第二[1]。該病起病隱匿，確診時大多數(shù)患者已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或至晚期，往往喪失了外科手術(shù)機(jī)會，是病死率極高的惡性腫瘤之一。

水通道蛋白- 3(aquaporin3,AQP3)和其他水通道蛋白一樣，是一種內(nèi)在蛋白，位于細(xì)胞膜上，其主要生物學(xué)功能是在細(xì)胞內(nèi)控制H2O的進(jìn)出。近期研究表明，AQP3在細(xì)胞中表達(dá)異?？赡芘c一些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。本研究擬通過檢測AQP3在胰腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況，進(jìn)一步分析其與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系，為探討AQP3在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例組織來源：選擇云南省第一人民醫(yī)院2014年6月至2017年1月行胰腺癌外科根治術(shù)后癌旁組織及癌組織標(biāo)本共86例。手術(shù)時收集同一患者胰腺癌組織及距癌緣5 cm以外的癌旁正常胰組織作為對照。所有標(biāo)本均并通過本院倫理委員會批準(zhǔn)，并經(jīng)患者知情同意。

1.1.2 主要試劑：鼠抗人β-actin單克隆抗體、兔抗人AQP3單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠二抗和RNA提取試劑(Trizol)(invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(Omega公司)。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測mRNA：按照Trizol試劑說明書操作提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在PubMed基因庫中檢索到AQP3與GAPDH的mRNA全基因序列，采用Primer5.0軟件設(shè)計引物，引物由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。預(yù)期擴(kuò)增的AQP3產(chǎn)物長度226 bp,引物序列如下，上游引物：5′-TCAATGGCTTCTTTGACCAGTTCA-3′;下游引物:5′-CT TCACATGGGCCAGCTTCACATT-3′。RT-PCR反應(yīng)條件：體系總體積為20 μL，分別加入cDNA 1 μL、10×緩沖液2 μL、dNTP(10 mmol/L)0.4 μL、MgCl2(25 mmol/L)1.6 μL、Taq酶(1 U/μL)0.2 μL、上游引物(10 μmol/L)0.5 μL、下游引物(10 μmol/L)0.5 μL、雙蒸水13.8 μL。94℃預(yù)變性，末次延伸10 min，共25個循環(huán)。AQP3的反應(yīng)條件是：94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min；GAPDH的反應(yīng)條件：94 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定：免疫組織化學(xué)染色按試劑盒實驗步驟操作。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：在胞膜、胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色。AQP3免疫組化評分方法：選擇5個高倍視野(×200)計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，得出陽性細(xì)胞百分率，分為4個等級：陽性細(xì)胞數(shù)<5%為陰性，5% ～ 25%為弱陽性，26% ～ 50%為中等強(qiáng)度陽性，>50%為強(qiáng)陽性，分別計為0，1，2和3分。

1.2.3 Western blot檢測：分別稱取0.1 g胰腺癌組織和癌旁組織，加800 μL全蛋白提取液提取蛋白。各組150 μg上樣于5.0%濃縮膠，15%分離膠，行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)PVDF膜，加一抗及β-actin封閉，4 ℃過夜，加二抗37 ℃條件溫育2 h，顯影檢測。免疫印跡條帶的吸光度值經(jīng)吸光度掃描儀分析后獲得。

2 結(jié)果

2.1 AQP3 mRNA表達(dá):AQP3在人的胰腺癌組織中表達(dá)豐富，癌旁組織中卻低表達(dá)或沒有表達(dá)(圖1)。

2.2 免疫組織化學(xué)染色檢測:AQP3主要存在于胰腺癌細(xì)胞膜,陽性反應(yīng)呈棕黃色或棕褐色, 而腫瘤旁組織中未檢測到其表達(dá)，胰腺癌組織中AQP3表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P<0.01)(圖2)。

2.3 Westen blot結(jié)果：AQP3在胰腺癌組織中表達(dá)豐富，癌旁組織表達(dá)相對較低(圖3)。

1.marker; 2.para carcinoma tissue; 3.carcinoma tissue圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測AQP3 mRNA表達(dá)Fig 1 Expression of AQP3 mRNA by agarose electrophoresis

A.para-carcinoma tissue; B.carcinoma tissue圖2 AQP3的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig 2 Immunohistochemical results of AQP3(×200)

a.para-carcinoma tissue; b,c.carcinoma tissue; *P<0.01compare with control group圖3 Westen blot檢測AQP3蛋白表達(dá)Fig 3 AQP3 expression evaluated by Westen blot

2.4 AQP3陽性率與腫瘤分化程度的相關(guān)性:AQP3的陽性率在高分化腺癌(52.9%)顯著低于低分化腺癌中(94.1%)。(P<0.01)(表1)。

表1 胰腺癌腺癌組織AQP3陽性率與腫瘤分化程度的關(guān)系

*P<0.01 compared with high differentiation.

3 討論

胰腺癌細(xì)胞和其他惡性腫瘤細(xì)胞一樣，更需要水的快速跨膜轉(zhuǎn)運，以維持此快速、無限的增殖和分裂，在此過程中AQPs可能發(fā)揮著極其重要的作用。目前文獻(xiàn)報道AQPs與腫瘤的關(guān)系在以下幾個方面的研究有所進(jìn)展和突破：1)AQPs除了促進(jìn)水在腫瘤細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運，還可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)，從而誘導(dǎo)其血管增生和遷移[3]；2)AQPs在腫瘤和正常組織中存在著差異表達(dá)；3)應(yīng)用AQPs阻滯劑可以阻滯抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。

本研究通過RT-qPCR、免疫組織化學(xué)、Western blot檢測所得結(jié)果均提示，AQP3 在胰腺癌組織豐富表達(dá)，癌旁組織中低水平表達(dá)或不表達(dá)，二者之間存在明顯差異。因此，AQP3可能影響了胰腺癌的臨床生物學(xué)特性，為進(jìn)一步探討AQP3在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了線索。

參考文獻(xiàn):

[1] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2013 [J]. CA Cancer J Clin, 2013, 63:11- 30.

[2] Rubenwolf P, Thomas C, Denzinger S,etal. Loss of AQP3 protein expression is associated with worse progression-free and cancer-specific survival in patients with muscle-invasive bladder cancer[J]. World J Urol, 2015, 33: 1959- 1964.

[3] Shen Q, Lin W, Luo H,etal. Differential expression of aquaporins in cervical precursor lesions and invasive cervical cancer[J]. Reprod Sci, 2016, 23: 1551- 1558.

[4] Wang J, Feng L, Zhu Z,etal. Aquaporins as diagnostic and therapeutic targets in cancer: how far we are? [J]. J Transl Med, 2015, 13:96- 100.