王如嶺，衛(wèi)小鳳，齊 闊，王黎明，李 瑩2,,4，白仲添2,,4，嚴(yán) 祥*

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 1.老年病科； 2.普外二科； 3.甘肅省生物治療與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.甘肅省肝膽胰研究所，甘肅 蘭州730000)

外泌體(exosome)是由細(xì)胞內(nèi)多泡體與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外隙或生物學(xué)體液中的膜性囊泡[1]，廣泛存在于人體大多數(shù)體液中如血液、尿液和唾液等[2]，其中包含有蛋白質(zhì)、RNA、microRNA和DNA片段等[3]多種成分，參與人體許多重要的生理或病理過程，在細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、免疫反應(yīng)和腫瘤細(xì)胞增殖等方面起了重要的作用，影響疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。目前，外泌體的生物學(xué)研究受到極大關(guān)注，其相應(yīng)的提取和鑒定方法是展開相關(guān)研究的重要前提。本研究報(bào)道了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)外泌體的一種分離和鑒定方法，為外泌體的深入研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)BALB/C小鼠，雄性8 只，體質(zhì)量20～30 g[中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(甘)2015- 0001]。

1.1.1 主要試劑：DMEM/ F1培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清(Hyclone 公司)；雙抗(青霉素及鏈霉素，Gibco公司)；PBS緩沖液、CD單克隆抗體(BD公司)；外泌體提取試劑盒(Invitrogeng公司)；細(xì)胞裂解、蛋白抽提試劑和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo Fisher公司);兔抗鼠CD9、CD63單克隆抗體 (SBI公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：用全骨髓貼壁培養(yǎng)方法進(jìn)行BMSCs的培養(yǎng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整為1×106個(gè)/mL后移入25 cm2培養(yǎng)瓶，放置于含5% CO2、37 ℃飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，72 h后全量換液。此后每2～3 d更換培養(yǎng)液。當(dāng)原代細(xì)胞增殖匯合至80%左右時(shí)進(jìn)行傳代，以后每3～5 d傳代1 次。

1.2.2 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定：選擇匯合度80%左右第3 代BMSC進(jìn)行表面鑒定。棄去培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基，加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化離心，離心后的沉淀用1×PBS緩沖液清洗2 遍，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞為1×106個(gè)/mL，并移入1.5 mL EP管中，每管分別加入CD73抗體、CD105抗體和CD45抗體，37 ℃避光，孵育30 min，再以1×PBS洗滌3 次，行流式細(xì)胞分析。

1.2.3 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的分離：待細(xì)胞增殖狀態(tài)良好后，血清改為無外泌體血清繼續(xù)培養(yǎng)。收集培養(yǎng)第3代間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，經(jīng)0.22 μm濾器過濾，再經(jīng)超濾管濃縮。然后按照提取試劑盒說明書加入相應(yīng)比例的試劑和濃縮上清，混勻后4 ℃ 孵育過夜，4 ℃，10 000×g離心1 h，然后吸取上清，最后獲得的沉淀為外泌體。

1.2.4 外泌體的鑒定

1.2.4.1 電鏡檢測外泌體: 取分離純化外泌體10 μL，加入等體積PBS 稀釋后滴加于2 mm的載樣銅網(wǎng)上，于室溫靜置1 min 后用濾紙將多余液體輕輕吸去，用3%(w/v) 磷鎢酸鈉溶液室溫負(fù)染1 min，用雙蒸水輕輕洗1 遍后室溫晾干，于透射電子顯微鏡觀察并照相。

1.2.4.2 Nano-ZS檢測外泌體粒徑: 將分離得到外泌體沉淀用1 mL經(jīng)過濾的PBS混勻，然后緩慢注入儀器進(jìn)行檢測，并保存分析數(shù)據(jù)。

1.2.4.3 流式細(xì)胞儀檢測外泌體標(biāo)志物: 經(jīng)抽提分離得到外泌體沉淀，用100 μL經(jīng)過濾的PBS混勻，密封冰上保存，CD63和CD81兩組抗體染色，標(biāo)記為CD63和CD81；不染色的外泌體作為陰性對照，標(biāo)記為陰性對照NC。上機(jī)檢測。

1.2.4.4 Western blot檢測外泌體標(biāo)志性蛋白: 收集分離得到的外泌體，細(xì)胞裂解和蛋白抽提試劑提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。配置 5%濃縮膠和 10%分離膠進(jìn)行 SDS-PAGE電泳。在 S1模式電壓80 V和 S2模式120 V電壓下分離，250 mA將凝膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，2% BSA封閉液室溫?fù)u床搖動(dòng)封閉 1 h，加入兔抗鼠一抗(CD9 1∶1 000; CD63 1∶1 000; GAPDH 1∶1 000) 4 ℃孵育過夜。TBST漂洗后加入羊抗鼠二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，再次TBST漂洗，ECL顯色。

2 結(jié)果

2.1 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子的鑒定

第3 代 BMSC:CD45呈陰性表達(dá)，CD73和 CD105呈陽性表達(dá)(圖1)。BMSC表面分子表達(dá)情況為∶CD45 0.8%、CD73 98.6%和CD105 95.9%。

2.2 透射電鏡觀察外泌體形態(tài)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體呈圓形或橢圓形，大小不均勻，直徑約30～100 nm，有完整的膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)含低密度物質(zhì)(圖2)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Fig 1 Flow cytometry profile of BMSCs

圖2 電鏡下的外泌體形態(tài)Fig 2 Transmission electron micrograph of exosome

2.3 外泌體粒徑分析

外泌體平均粒徑23.99 nm，粒徑主峰61.25 nm。粒子分布系數(shù)(polymer dispersity index，PDI)0.517 (圖3)。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測外泌體表面標(biāo)志物

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體CD63和CD81呈陽性表達(dá)(圖4)。

2.5 Western blot檢測外泌體特異標(biāo)志蛋白CD9和CD63

提取的外泌體表達(dá)CD63和CD9蛋白(圖5)。

3 討論

目前，外泌體的研究取得了很大的研究進(jìn)展，但總體還是處于研究的初始階段并且面臨著很多的挑戰(zhàn)[5]。外泌體分離與鑒定的研究是該領(lǐng)域探索的重要基礎(chǔ)。本研究選取小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，采用全骨髓貼壁法進(jìn)行培養(yǎng)，并用流式細(xì)胞對其進(jìn)行了表型鑒定，結(jié)果顯示符合干細(xì)胞的特征；在培養(yǎng)細(xì)胞和收集細(xì)胞培養(yǎng)上清的過程中進(jìn)行了改良，該方法也可適用于其他細(xì)胞來源外泌體的分離，具有一定的借鑒意義。在細(xì)胞增殖狀態(tài)良好時(shí)改用無外泌體血清，保證了細(xì)胞的營養(yǎng)需要，較饑餓培養(yǎng)效果更好；通過濾器和超濾管收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，起到了純化和濃縮的作用，大大的節(jié)省了外泌體提取試劑并且可以獲得更多更純的外泌體； 透射電鏡觀察提取物，發(fā)現(xiàn)背景雜質(zhì)少，顆粒外觀符合外泌體典型特征；用目前較為先進(jìn)的納米技術(shù)對外泌體進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：外泌體平均粒徑23.99 nm，粒徑主峰61.25 nm，均在外泌體理論的粒徑范圍內(nèi)；粒子分布系數(shù)(PDI)0.517在0.08～0.7之間，證明體系分散度適中，檢測結(jié)果置信度高；外泌體粒徑中20～200 nm范圍占70%以上，與外泌體的粒徑分布吻合；流式檢測外泌體表面標(biāo)志性蛋白CD6和CD81的表達(dá)，均呈陽性，符合外泌體的特征；蛋白CD63和CD9在所有的外泌體中均呈現(xiàn)陽性，Western blot過程中采用兩個(gè)復(fù)孔進(jìn)行驗(yàn)證，均呈陽性表達(dá)，符合外泌體特征。

圖3 外泌體粒徑密度分布Fig 3 Size distribution by intensity of exosome

圖4 流式細(xì)胞檢測外泌體標(biāo)志物Fig 4 Flow cytometry profile of exosome markers

圖5 Western blot檢測外泌體蛋白Fig 5 Expression of CD9 and CD63 in exosome by Western blot

綜上所述，本研究針對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的分離和鑒定是可行的，并具有一定的創(chuàng)新性和借鑒意義，為外泌體的深入研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。外泌體內(nèi)含有與細(xì)胞來源相關(guān)的蛋白質(zhì)、DNA、mRNA 和 miRNA等[6]，其作用漸漸為人們所重視，外泌體是由細(xì)胞分泌的，可以行使部分細(xì)胞功能，在體內(nèi)的安全性優(yōu)于細(xì)胞療法，同時(shí)他還能夠通過生物屏障，在細(xì)胞間傳遞功能性核酸分子，從而發(fā)揮各種生物學(xué)功能。外泌體有望成為腫瘤檢測和診斷的生物標(biāo)志物[7]、新型給藥途徑[8]、基因治療[9]和無細(xì)胞治療載體[10]，對于疾病的診斷、治療和預(yù)后判斷具有重要的研究價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

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