白瑜珊，焦時宇，曲愛娟

(首都醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)與病理生理學(xué)系 重塑相關(guān)心血管疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069)

低氧可以誘發(fā)炎性反應(yīng)，尤其在促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β, IL- 1β)的產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用[1- 2]。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種復(fù)雜的慢性炎性反應(yīng)疾病，IL- 1β在AS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3- 5]。研究表明低氧可以作為一種新的危險信號促進(jìn)AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞IL- 1β的產(chǎn)生[1, 6]，因此，研究低氧對IL- 1β轉(zhuǎn)錄、翻譯、成熟和分泌的機(jī)制可能對找到治療AS的新靶點(diǎn)有重要意義。IL- 1β主要來源于巨噬細(xì)胞[7]，是固有免疫和炎性反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞IL- 1β的轉(zhuǎn)錄和翻譯[8]，而IL- 1β的加工和分泌主要通過NOD樣受體3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor 3, NLRP3)炎性小體激活半胱氨酸天冬蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1, caspase- 1)后介導(dǎo)[9]。有研究表明低氧可放大LPS處理后人巨噬細(xì)胞中IL- 1β的表達(dá)，且介導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性低氧反應(yīng)的主要核轉(zhuǎn)錄因子1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF- 1α)與IL- 1β、caspase- 1在AS斑塊巨噬細(xì)胞中存在共定位[1]。但低氧對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL- 1β的作用及機(jī)制尚不清楚。因而，本文將研究低氧對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL- 1β的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動物：具有C57BL/6J背景的巨噬細(xì)胞特異性希佩爾林道蛋白(Von Hippel-Lindau, VHL)基因敲除(VhlΔMac/Apoe-/-)小鼠和同窩對照(Vhlfl/fl/Apoe-/-)小鼠(美國國立衛(wèi)生研究院Frank J.Gonzalez課題組)。小鼠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物房，提取腹腔巨噬細(xì)胞所用的小鼠均為8～10周齡。實(shí)驗(yàn)動物的使用遵循首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例，并通過首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞：Abelson小鼠白血病病毒誘導(dǎo)的腫瘤RAW264.7巨噬細(xì)胞細(xì)胞系(北京市心肺血管疾病研究所所贈)及小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞(從VhlΔMac/Apoe-/-小鼠和同窩對照Vhlfl/fl/Apoe-/-小鼠中提取所得)。

1.1.3 主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、丙酮酸鈉(Hyclone公司)；LPS(Sigma-Aldrich公司)；Brewer改良巰基乙醇酸鹽肉湯(BD公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)；RT-qPCR引物(Sangon Biotech公司)；RIPA裂解液(Solarbio公司)；蛋白酶抑制劑HaltTMProtease Inhibitor Cocktail(Thermo Fisher Scientific公司)；核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒(凱基生物公司)；β-actin小鼠單克隆抗體、laminB1單克隆一抗和caspase- 1單克隆一抗(Abcam公司)；HIF-1α小鼠單克隆抗體(Novus Biologicals公司)；NLRP3大鼠單克隆一抗(RD公司)；大鼠HRP二抗(中杉金橋生物技術(shù)公司)；IL- 1β小鼠單克隆抗體、小鼠HRP二抗和兔HRP二抗(Cell Signaling公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RAW264.7的細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理：將RAW264.7培養(yǎng)在含4×10-3mol/L L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖、1×10-3mol/L丙酮酸鈉、1.5 g/L NaHCO3和10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中，細(xì)胞貼壁8～10 h后，用含1% FBS的上述培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)8～10 h，分別于37 ℃、5% CO2、21% O2的培養(yǎng)箱及37 ℃、5% CO2、2% O2的精密三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞的常氧及低氧培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)分組：1)常氧組：常氧(21% O2)培養(yǎng)24 h；2)常氧+LPS組：常氧培養(yǎng)24 h后LPS(5×10-3ng/L)培養(yǎng)4 h；3)低氧組：低氧(2% O2)培養(yǎng)24 h；4)低氧+LPS組：低氧培養(yǎng)24 h后LPS培養(yǎng)4 h。

1.2.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及分組處理：實(shí)驗(yàn)前3 d給予小鼠腹腔注射3%巰基乙醇酸鈉，每只2 mL。3 d后提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2、21% O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)分組：1)對照組：Vhlfl/fl/Apoe-/-及VhlΔMac/Apoe-/-腹腔巨噬細(xì)胞給予PBS；2)LPS組：Vhlfl/fl/Apoe-/-及VhlΔMac/Apoe-/-腹腔巨噬細(xì)胞LPS(50×10-3ng/L)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 總RNA提取和RT-qPCR檢測Vegf、Nlrp3、Il1b、Vhl和Il6的mRNA表達(dá)水平：利用Trizol有機(jī)溶劑抽提法提取細(xì)胞總RNA，定量后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。利用RT-qPCR檢測目的基因mRNA的表達(dá)水平(引物序列見表1)。

1.2.4 Western blot檢測HIF- 1α、NLRP3、caspase- 1、cleaved caspase- 1、Pro-IL- 1β和IL- 1β的蛋白水平：利用RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑提取細(xì)胞總蛋白，利用核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞核蛋白及細(xì)胞漿蛋白。蛋白變性后，經(jīng)SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后，孵育一抗及二抗，利用化學(xué)發(fā)光法顯色發(fā)光，隨后使用Image J進(jìn)行吸光度值分析的統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 低氧可顯著升高RAW264.7細(xì)胞中Nlrp3和Il1b的mRNA水平

與常氧組相比，低氧能使RAW264.7細(xì)胞中Vegf、Nlrp3、Il1b的mRNA水平顯著上調(diào)(P<0.01)(圖1)。

2.2 低氧可升高LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NLRP3、IL- 1β的mRNA及蛋白水平

與常氧組相比，給予LPS培養(yǎng)后，低氧能顯著增加LPS誘導(dǎo)的NLRP3和IL- 1β的mRNA及蛋白水平(P<0.01)，但不能誘導(dǎo)caspase- 1激活及Pro-IL- 1β剪切。此外，與常氧組相比，給予LPS培養(yǎng)后，低氧聯(lián)合LPS還能升高HIF- 1α的蛋白水平及其經(jīng)典靶基因Vegf的mRNA水平(P<0.05)(圖2)。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

*P<0.01, **P<0.001 compared with normoxia group圖1 低氧可升高RAW264.7細(xì)胞中Nlrp3和Il1b的mRNA水平Fig 1 Hypoxia increased the mRNA levels of Nlrp3 and Il1b in RAW264.7 n≥3)

RAW264.7 cells were stimulated with 5 ng/mL LPS for 4 hours; A.the mRNA levels ofVegf,Nlrp3andIl1bwere determined by RT-qPCR; B.cell lysates were fractionated by SDS-PAGE and immunoblotted with antibodies to HIF- 1α, NLRP3, caspase- 1, cleaved caspase- 1, Pro-IL- 1β,IL- 1β,β-actin and LaminB1; densitometric analyses of the bands corresponding to HIF- 1α, NLRP3 and Pro-IL- 1β,β-actin and LaminB1 were served as internal control;*P<0.05,**P<0.01 compared with normoxia control group;#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001 compared with LPS stimulation group

圖2低氧可升高RAW264.7細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的NLRP3和IL-1β的mRNA及蛋白水平

2.3 特異性敲除巨噬細(xì)胞Vhl可升高LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Nlrp3和Il1b的mRNA水平

RT-qPCR結(jié)果顯示，VhlΔMac/Apoe-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Vhl基因的敲除效率為20%以下(P<0.001)。與Vhlfl/fl/Apoe-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞相比，給予LPS(50×10-3ng/L 24 h)培養(yǎng)后，VhlΔMac/Apoe-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Nlrp3、Il1b和Il6的mRNA水平顯著升高(P<0.05)(圖3)。

3 討論

本研究表明低氧可升高RAW264.7細(xì)胞中Nlrp3和Il1b的mRNA水平，放大LPS誘導(dǎo)的NLRP3和IL- 1β mRNA和蛋白水平，促進(jìn)巨噬細(xì)胞IL- 1β的產(chǎn)生，并且特異性敲除巨噬細(xì)胞Vhl可顯著升高LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Nlrp3和Il1b的mRNA水平。以上結(jié)果表明低氧或Vhl敲除可升高LPS誘導(dǎo)的NLRP3和IL- 1β mRNA及蛋白水平，提示HIFs激活可能在此過程中發(fā)揮重要作用。

HIFs是調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的主要轉(zhuǎn)錄因子，由α和β亞基構(gòu)成異二聚體，HIFs主要受脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylases, PHDs)羥基化后經(jīng)VHL介導(dǎo)的蛋白酶體途徑降解[10]。低氧或敲除Vhl可導(dǎo)致HIFs經(jīng)蛋白酶體降解途徑受阻，HIFs在細(xì)胞內(nèi)積聚并促進(jìn)其靶基因的轉(zhuǎn)錄。有研究表明低氧可通過延長LPS誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞中Pro-IL- 1β的半衰期增加其蛋白水平，但低氧不增加LPS誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞中的IL1βmRNA水平[1]。另一項(xiàng)研究表明低氧可擴(kuò)大LPS誘導(dǎo)的小鼠骨髓巨噬細(xì)胞IL- 1β的分泌[11]。這與本研究結(jié)果不完全一致。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧不僅可以促進(jìn)RAW264.7中Nlrp3和Il1b的mRNA水平升高，還可進(jìn)一步促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的NLRP3和IL- 1β mRNA及蛋白水平升高，但低氧不能誘導(dǎo)Pro-IL- 1β剪切。本研究與以往研究不完全一致的原因可能是由于巨噬細(xì)胞種屬不同及LPS處理的時間、劑量不同。本研究還發(fā)現(xiàn)特異性敲除巨噬細(xì)胞Vhl所誘導(dǎo)的HIFs持續(xù)激活可進(jìn)一步升高LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Nlrp3和Il1b的mRNA水平。研究表明低氧通過HIF- 1α-NLRP3-IL- 1β軸可加重小鼠靜脈血栓栓塞[12]，且HIF- 1α可通過促進(jìn)IL- 1β的轉(zhuǎn)錄和分泌參與巨噬細(xì)胞IL- 1β產(chǎn)生[11]。在本研究中，HIF- 1α-NLRP3-IL- 1β軸也可能在低氧增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的IL- 1β表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared withVhlfl/fl/Apoe-/-vehicle group;#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001 compared withVhlfl/fl/Apoe-/-with LPS stimulation group

綜上所述，低氧可能通過激活HIFs升高LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NLRP3和IL- 1β的mRNA和蛋白水平，進(jìn)而參與低氧增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的IL- 1β表達(dá)。然而，低氧調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞IL- 1β產(chǎn)生的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Folco EJ, Sukhova GK, Quillard T,etal. Moderate hypoxia potentiates interleukin-1 beta production in activated human macrophages[J]. Circ Res, 2014, 115:875-883.

[2] Cummins EP, Keogh CE, Crean D,etal. The role of HIF in immunity and inflammation[J]. Mol Aspects Med, 2016, 47- 48:24- 34.

[3] Chamberlain J, Evans D, King A,etal. Interleukin- 1 beta and signaling of interleukin- 1 in vascular wall and circulating cells modulates the extent of neointima forma-tion in mice[J]. Am J Pathol, 2006, 168:1396- 1403.

[4] Kirii H, Niwa T, Yamada Y,etal. Lack of interleukin- 1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003, 23:656- 660.

[5] Duewell P, Kono H, Rayner KJ,etal. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals[J]. Nature, 2010, 464:1357- 1361.

[6] Sergin I, Evans TD, Bhattacharya S,etal. Hypoxia in plaque macrophages: a new danger signal for interleukin- 1beta activation?[J]. Circ Res, 2014, 115:817- 820.

[7] Dinarello CA. Immunological and inflammatory functions of the interleukin- 1 family[J]. Ann Rev Immunol, 2009, 27:519- 550.

[8] Unlu S, Kumar A, Waterman WR,etal. Phosphorylation of IRF8 in a pre-associated complex with Spi- 1/PU.1 and non-phosphorylated Stat1 is critical for LPS induction of the IL1B gene[J]. Mol Immunol, 2007, 44:3364- 3379.

[9] Lamkanfi M, Dixit VM. Mechanisms and functions of inflammasomes[J]. Cell, 2014, 157:1013- 1022.

[10] Semenza GL. Oxygen sensing, hypoxia-inducible factors, and disease pathophysiology[J]. Ann Rev Pathol, 2014, 9:47- 71.

[11] Tannahill GM, Curtis AM, Adamik J,etal. Succinate is an inflammatory signal that induces IL- 1 beta through HIF- 1alpha[J]. Nature, 2013, 496:238- 242.

[12] Gupta N, Sahu A, Prabhakar A,etal. Activation of NLRP3 inflammasome complex potentiates venous thrombosis in response to hypoxia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2017, 114:4763- 4768.