劉益杰， 陳世宣， 趙仙麗， 寧長青， 馮 偉

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，上海 201203； 2. 溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院康復(fù)科，溫州 325000；3. 同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院傷科，上海 200120)

淫羊藿苷(icariin, ICA)是補腎中藥淫羊藿的主要有效成分，現(xiàn)代研究表明其對骨骼系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等均能發(fā)揮藥理作用[1-3]，然而淫羊藿苷對骨骼系統(tǒng)影響的研究主要集中在其調(diào)節(jié)成骨/破骨平衡進而防治骨質(zhì)疏松等方面，有關(guān)淫羊藿苷影響軟骨細胞代謝的研究尚少，仍然不清楚淫羊藿苷對骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變作用效果和機制。本課題組前期通過關(guān)節(jié)炎的動物模型論證了淫羊藿苷對骨免疫的調(diào)節(jié)作用[4-5]，并通過體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)炎患者來源滑膜成纖維細胞證實淫羊藿苷可以抑制滑膜細胞分泌炎性因子TNF-α，進而推測其具有調(diào)控炎癥介導(dǎo)的軟骨損傷和退變的潛能[6]。本研究通過IL-1β刺激軟骨細胞，模擬軟骨細胞炎性損傷和退變的病理，觀察不同濃度淫羊藿苷對軟骨細胞退變的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清雙抗、Hanks液購自美國Gibco公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶購自美國Hyclone公司；TRIzol、Ⅱ型膠原酶(collagen Ⅱ, Col-Ⅱ)購自美國Invitrogen公司；大鼠IL-1β購自美國PeproTech公司；MTT購自上海鼎國生物科技有限公司；SYBR@Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA eraser(Perfect Real Time)購自日本TaKaRa公司；氯仿、異丙醇購自國藥集團，引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成；大鼠Col-ⅡELISA試劑盒購自武漢華美生物有限公司。

超凈臺(VCM-620)購自珠海市再鑫儀器有限公司，Thermo 311 CO2培養(yǎng)箱購自Thermo公司，5417R高速冷凍離心機購自Eppendorf公司，CKX41熒光倒置相差顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司，DW-25L262低溫冰箱購自海爾醫(yī)療科技有限公司，SIM-F124制冰機購自SANYO公司，高壓蒸汽消毒器購自上海醫(yī)用核子儀器廠，ELX800酶標儀購自Bio-Tek，7500fast實時熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.2 關(guān)節(jié)軟骨細胞的分離、培養(yǎng)

參照以往研究中軟骨細胞分離步驟[7]： 無菌條件下剝離大鼠胎鼠四肢長骨，Hanks液清洗2遍，剔除肉眼可見軟組織，眼科剪分離骨骺端透明軟骨，手術(shù)刀片切成<1mm3的碎屑，于15mL無菌離心管中，用10倍體積含0.25%EDTA的胰酶于37℃水浴鍋消化40min，離心半徑15cm，2000r/min,離心5min，棄上清液，加入約10倍體積終濃度為0.5g/L的Ⅱ型膠原酶，置37℃水浴鍋繼續(xù)消化2h，加入等體積培養(yǎng)液終止消化，收集上清液，200目篩網(wǎng)過濾收集濾液，離心半徑15cm，1500r/min離心5min，棄上清液；加入適量含終濃度為1%雙抗和10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液(不含額外添加的生長因子等)重懸細胞，接種于10cm培養(yǎng)皿，記為P0代，常規(guī)培養(yǎng)傳代。

1.3 MTT法測定不同濃度淫羊藿苷對軟骨細胞增殖的效果

取P1代軟骨細胞，以4×103/孔接種于96孔板，設(shè)置空白對照組(常規(guī)培養(yǎng)： 10% FBS+1%雙抗+89%RPMI-1640培養(yǎng)基，不含額外添加的生長因子)、淫羊藿苷不同劑量組(常規(guī)培養(yǎng)基礎(chǔ)上加入不同濃度ICA干預(yù)，終濃度分別為1×10-7、1×10-6和 1×10-5mol/L)，每組4個復(fù)孔。細胞貼壁6h 后更換新的培養(yǎng)液并棄去未貼壁細胞，繼續(xù)培養(yǎng)12h后加入淫羊藿苷進行干預(yù)，分別于不同時間點(12、24、36、48、60、72h)以MTT法檢測細胞增殖情況。

1.4 IL-1刺激軟骨細胞炎癥損傷和退變及淫羊藿苷的干預(yù)作用

取P1代軟骨細胞，以1.2×105/孔密度接種于6孔板，設(shè)置空白對照組(N組)、炎癥刺激組(M組)和淫羊藿苷低、高劑量組(ICA-L、ICA-H組，終濃度分別為1×10-7、1×10-6mol/L)，每組3個復(fù)孔。細胞貼壁6h后更換新的培養(yǎng)液并棄去未貼壁細胞，除N組外，M組、ICA-L組和ICA-H組均加入終濃度為10ng/mL的IL-1β誘導(dǎo)軟骨細胞炎癥和損傷，12h后ICA-L組和ICA-H組分別加入相應(yīng)濃度淫羊藿進行干預(yù)，連續(xù)干預(yù)72h。收集細胞并提取RNA，RT-PCR法檢測。引物序列如下。Col-Ⅱ上游引物： 5′-GAGGGCAACAGCAGGTTCAC-3′,下游引物： 5′-GCCCTATGTCCACACCAAATTC-3′；Acan上游引物： 5′-TGGCATTGAGGACAGCGAAG-3′,下游引物： 5′-TCCAGTGTGTAGCGTGTGGAAAT-AG-3′；MMP13上游引物： 5′-GATGATGAAACCTGGACA-AGCA-3′,下游引物： 5′-GAACGTCATCATCTGG-GAGCA-3′；Sox9上游引物： 5′-GAAAGACCACCC-CGATTACAAG-3′,下游引物： 5′-AAGATGGCGT-TAGGAGAGATGTG-3′。反轉(zhuǎn)錄cDNA：取2μg總RNA，加入4μL的5×RT master mix，加RNase-free H2O至20μL，混勻離心。PCR擴增：10μL SYBR Green， 上、下游引物各1μL，0.4μL RoxDye(Ⅱ)，2μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，5.6μL RNase-free H2O，共20μL。預(yù)變性95℃ 30s；變性95℃ 3s，退火、延伸60℃ 30s，共40個循環(huán)。根據(jù)所測Ct值，用2-ΔΔCt法計算出各個mRNA的相對表達量。細胞培養(yǎng)上清液，用ELISA法檢測Col-Ⅱ和GAG含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 淫羊藿苷對軟骨細胞增殖的影響

MTT法顯示，1×10-5mol/L淫羊藿苷干預(yù)72h后促進軟骨細胞增殖(P<0.01)，但在早期(24h)表現(xiàn)為抑制軟骨細胞增殖(P<0.01)，在干預(yù)48h和60h后對軟骨細胞增殖無明顯作用。1×10-6mol/L濃度ICA干預(yù)軟骨細胞36h后，與空白對照組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)36h后，1×10-7mol/L淫羊藿苷除60h時間點外，其余時間點與空白對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。干預(yù)72h后，1×10-7mol/L淫羊藿苷促進軟骨細胞增殖作用最為明顯，見表1。

表1不同濃度ICA對軟骨細胞增殖的作用

組別D45012h24h36h48h60h72h空白對照組0．21±0．010．27±0．010．26±0．010．45±0．020．59±0．020．67±0．0110-7mol/LICA?10．23±0．010．29±0．020．38±0．01#0．52±0．02##0．61±0．050．98±0．03##10-6mol/LICA?10．23±0．01#0．26±0．010．43±0．02##0．56±0．07#0．72±0．10#0．88±0．02##10-5mol/LICA?10．26±0．03#0．20±0．02##0．41±0．01##0．46±0．04#0．57±0．040．85±0．04##

與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.2 淫羊藿苷對IL-1β刺激軟骨細胞分泌Col-Ⅱ和GAG的影響

M組上清液中分泌性蛋白Col-Ⅱ較N組降低但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.11)；ICA-L組、ICA-H組Col-Ⅱ濃度與M組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.19，P=0.31)。M組上清中GAG含量較N組顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01)，淫羊藿苷干預(yù)后，ICA-L組和ICA-H組上清液中GAG含量均顯著提高(均為P=0.00)，見圖1。

圖1 淫羊藿苷對IL-1β刺激下軟骨細胞分泌Col-Ⅱ和GAG的影響Fig.1 Effects of ICA on Col-Ⅱand GAG secretion in chondrocytes stimulated by IL-1β與N組比較，#P<0.05;##P<0.01

2.3 淫羊藿苷對IL-1β刺激軟骨細胞Col-Ⅱ、MMP13、Acan和Sox9 mRNA表達的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，IL-1β炎性因子刺激軟骨細胞3d后，與N組比較，M組Acan mRNA水平降低(P<0.05)、MMP13 mRNA水平升高(P<0.01)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；Col-Ⅱ mRNA水平幾乎沒有變化，Sox9 mRNA水平雖然降低但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。與M組比較，ICA-L組Acan和Sox-9 mRNA表達升高(均為P<0.01)，Col-Ⅱ mRNA、MMP13 mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)；而高劑量淫羊藿苷能顯著提高Col-Ⅱ mRNA水平，并抑制MMP13 mRNA表達(均為P<0.01)，但對Sox9/Acan mRNA表達沒有明顯影響(均為P>0.05)，見圖2。

圖2 淫羊藿苷對軟骨細胞Col-Ⅱ/Acan/MMP13/Sox9 mRNA表達情況Fig.2 Effects of ICA on Col-Ⅱ/Acan/MMP13/Sox9 mRNA expression in chondrocytes stimulated by IL-1β與N組比較，#P<0.05，##P<0.01;與M組比較，*P<0.01

3 討 論

關(guān)節(jié)軟骨退變是骨關(guān)節(jié)炎形成與發(fā)展的核心環(huán)節(jié)，如何延緩軟骨退變亦是骨關(guān)節(jié)炎防治的重點和難點。臨床應(yīng)用含有淫羊藿等滋補肝腎、活血通絡(luò)類中藥治療骨關(guān)節(jié)炎取得一定療效[8-9]，進一步的動物實驗采用單藥淫羊藿治療膝骨關(guān)節(jié)炎，結(jié)果表明單藥淫羊藿能緩解木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的早期兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變[10-11]。淫羊藿的主要有效成分為淫羊藿苷，有研究已經(jīng)證實淫羊藿苷能影響軟骨細胞增殖，然而其作用效果與ICA濃度和干預(yù)時間的關(guān)系仍未明確。

王鵬珍團隊的研究[12]結(jié)果顯示，1×10-6mol/L ICA促進軟骨細胞增殖作用明顯，而1×10-5mol/L ICA始終(連續(xù)5d)未明顯促進軟骨細胞增殖，甚至在第3天表現(xiàn)為抑制增殖作用，但繼續(xù)干預(yù)7d和14d后所有濃度均明顯促進軟骨細胞分泌蛋白聚糖。Zhang等[13]觀察5×10-5、1×10-5、5×10-6、1×10-6、1×10-7mol/L濃度ICA對軟骨細胞的作用效果，干預(yù)5d后MTT增殖實驗和激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果均顯示，1×10-5mol/L對軟骨細胞增殖有抑制趨勢，更高濃度(5×10-5mol/L)則表現(xiàn)為明顯抑制作用，表現(xiàn)為融合區(qū)域大幅度減少；隨著干預(yù)時間延長(至7～14d后)，所有濃度均表現(xiàn)為促進軟骨細胞基質(zhì)合成作用，且呈現(xiàn)劑量依賴趨勢。因此，淫羊藿苷對軟骨細胞的長期(>7d)效果可能表現(xiàn)為促進軟骨細胞增殖，而短期(<7d)效果似乎與ICA藥物劑量有關(guān)。

本研究中觀察了1×10-7、1×10-6和1×10-5mol/L濃度的ICA對軟骨細胞干預(yù)12～72h的作用效果，結(jié)果顯示高劑量淫羊藿苷干預(yù)早期(24h內(nèi))抑制軟骨細胞增殖的趨勢，隨著干預(yù)時間的延長(特別是干預(yù)36h后)，各濃度淫羊藿苷組促進軟骨細胞增殖的趨勢愈加明顯；干預(yù)72h后，1×10-7mol/L淫羊藿苷促進軟骨細胞增殖作用最為明顯。值得注意的是Liu等[14]的研究結(jié)果顯示，在10-10、10-9、10-8、10-7mol/L幾個劑量中，更低劑量(10-9mol/L)ICA促進軟骨細胞增殖作用最為明顯，且該濃度拮抗LPS引起的軟骨細胞增殖抑制的效果最佳，隨著時間延長這一效應(yīng)更加明顯。與Liu等的研究結(jié)論不同，本研究結(jié)果提示在1×10-7mol/L和1×10-6mol/L兩個濃度中，更高劑量(1×10-6mol/L)似乎更能拮抗IL-1β引起的軟骨細胞分泌Col-Ⅱ和GAG含量降低，緩解炎癥因子引起的軟骨細胞退變，促進Col-ⅡmRNA表達，降低MMP13 mRNA的表達；而低劑量(1×10-7mol/L)對Acan和Sox9 mRNA的表達更為敏感。

綜上，此次研究結(jié)果表明淫羊藿苷具有促進軟骨細胞增殖的作用，能影響軟骨細胞外基質(zhì)環(huán)境，調(diào)節(jié)軟骨細胞表型特異基因的表達水平，拮抗IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞退變。然而淫羊藿苷影響軟骨細胞代謝的量效關(guān)系和作用機制，仍有待進一步觀察和探索，特別是淫羊藿苷“長期”和“短期”效應(yīng)的差異、“短期”是否存在雙向調(diào)節(jié)機制等。

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