何玲，吳紅衛(wèi)，譚大為

1成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院風濕免疫血液科，成都 610500

2貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院血液科，貴州 貴陽 5500040

急性髓系白血病是造血系統(tǒng)的髓系原始細胞克隆性惡性增殖性疾病，是由正常髓系細胞分化發(fā)育過程中造血祖細胞的惡性轉變引起的[1]，具體的發(fā)病機制尚未完全明確。急性髓系白血病患者體內白細胞質量差，因此會引發(fā)多種并發(fā)癥，臨床表現(xiàn)主要以感染、持續(xù)性發(fā)熱、皮膚黏膜出血、貧血為主[2]。化療是臨床治療急性髓系白血病的有效手段，但化療耐藥和緩解后微小殘留病變的根除是臨床治療的棘手問題[3]。因此，尋找急性髓系白血病的血清標志物是臨床治療的關鍵。研究表明，WT1基因在多種惡性血液疾病中異常表達，其表達水平已成為臨床檢測急性髓系白血病的主要評判指標[4-5]。然而，WT1基因與白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、補體C3及C4表達水平的相關性尚未見報道。本研究選擇48例急性髓系白血病初治患者、25例急性髓系白血病緩解患者、29例急性髓系白血病復發(fā)患者和19例健康體檢者為研究對象，探討急性髓系白血病患者外周血WT1基因和血清IL-6、C3、C4的表達水平，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年3月至2017年3月于成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院和貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院治療的102例急性髓系白血病患者。所有患者均行血常規(guī)、免疫學、骨髓形態(tài)學、組織化學染色及染色體核型分析，均符合急性髓系白血病的診斷標準，確診為急性髓系白血病。急性髓系白血病初治患者48例，其中男26例，女22例；年齡24～36歲，平均（28.23±4.12）歲。急性髓系白血病緩解患者25例，其中男13例，女12例；年齡22～37歲，平均（27.36±4.22）歲。急性髓系白血病復發(fā)患者29例，其中男16例，女13例；年齡25～36歲，平均（27.82±4.06）歲。選取同期健康體檢者19例為對照組，其中男11例，女 8例；年齡 22～33歲，平均（26.92±4.06）歲。所有患者及家屬均對本研究知情并簽署知情同意書。4組研究對象的年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05），具有可比性。

1.2 診斷標準

急性髓系白血病的診斷標準：①符合英法美協(xié)作組（FAB協(xié)作組）及世界衛(wèi)生組織（WHO）對急性髓系白血病的診斷標準[6]；②符合《血液病診斷及療效分析》對急性髓系白血病的診斷標準[7]。納入標準：①骨髓原始細胞數(shù)≥20%；②伴有特殊染色體類型。排除標準：①伴有t（15；17）和t（8；21）等染色體易位的急性髓系白血病患者；②治療相關性急性髓系白血病患者；③骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）或骨髓增殖性疾?。╩yeloproliferative disorders，MPD）轉化而來的急性髓系白血病患者。

1.3 主要試劑及儀器

RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；TaqDNA聚合酶購自北京NEB公司；IL-6、C3、C4酶聯(lián)免疫試劑盒均購自上海賽默生物科技發(fā)展有限公司；Applied Biosystems熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；3K15超低溫離心機購自德國Sigma公司。

1.4 方法

1.4.1 采集受試者靜脈血 采集受試者空腹靜脈血3～5 ml至無菌的EDTA抗凝管中，置于-80℃冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測受試者外周血WT1 mRNA表達水平 取1.4.1中采集的靜脈血，應用RNA提取試劑盒提取總RNA，應用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。根據(jù)美國國立生物技術信息中心（NCBI）基因庫中WT1的cDNA序列設計引物，WT1上游引物為5′-CAGGCTGCAATAAGAGATATTTTAAGCT-3′，下 游 引 物 為 5′-GAAGTCACACTGGTATGGTTTCTCA-3′；GAPDH上 游 引 物 為 5′-CGTTGGCTTCCCAGAACATCAT-3′，下 游 引 物 為 5′-CATCGGACACATTGGGGGTAG-3′，以GAPDH為內參，行進qRT-PCR。PCR反應體系（50 μl）：5×PCR緩沖液10 μl，TaqDNA聚合酶 1 μl，上游引物 2 μl，下游引物 2 μl，10 mmol/L dNTP mix 1 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 33 μl。PCR 反應條件：95℃、5 min預變性，95℃、30 s變性，64℃、15 s延伸，共40個循環(huán)。采用最大二階導數(shù)法（2-△△Ct）對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，計算WT1的相對表達量?！鳌鰿t=（實驗組目的基因Ct平均值－實驗組內參基因Ct平均值）－（對照組目的基因Ct平均值－對照組內參基因Ct平均值）。

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測受試者血清IL-6、C3、C4表達水平 將1.4.1中采集的靜脈血置于超低溫離心機，3000 r/min離心5 min，收集上清液，分別用IL-6、C3、C4酶聯(lián)免疫試劑盒檢測血清IL-6、C3、C4的表達水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗；相關性分析采用Pearson直線相關分析。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 外周血WT1 mRNA表達水平的比較

急性髓系白血病初治組患者的WT1 mRNA表達水平高于對照組，急性髓系白血病緩解組患者的WT1 mRNA表達水平低于急性髓系白血病初治組，急性髓系白血病復發(fā)組患者的WT1 mRNA表達水平高于急性髓系白血病初治組，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。（表1）

2.2 血清IL-6、C3、C4表達水平的比較

急性髓系白血病初治組患者的IL-6、C3、C4表達水平均高于對照組，急性髓系白血病緩解組患者的IL-6、C3、C4表達水平均低于急性髓系白血病初治組，急性髓系白血病復發(fā)組患者的IL-6、C3、C4表達水平均高于急性髓系白血病初治組，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。（表2）

表1 4組研究對象外周血WT1 mRNA表達水平的比較（±s）

表1 4組研究對象外周血WT1 mRNA表達水平的比較（±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與急性髓系白血病初治組比較，P＜0.05

WT1 mRNA 0.21±0.05 0.76±0.21a 0.54±0.07a b 0.92±0.18a b對照組（n=19）急性髓系白血病初治組（n=48）急性髓系白血病緩解組（n=25）急性髓系白血病復發(fā)組（n=29）82.440 0.000組別F值P值

表2 4組研究對象血清IL-6、C3、C4表達水平的比較（±s）

表2 4組研究對象血清IL-6、C3、C4表達水平的比較（±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與急性髓系白血病初治組比較，P＜0.05

組別對照組（n=19）急性髓系白血病初治組（n=48）急性髓系白血病緩解組（n=25）急性髓系白血病復發(fā)組（n=29）F值P值IL-6（ng/ml）0.24±0.03 0.72±0.14a 0.49±0.06a b 0.89±0.15a b 134.928 0.000 C3（g/L）0.46±0.08 0.94±0.15a 0.76±0.12a b 1.22±0.21a b 102.153 0.000 C4（g/L）0.32±0.05 0.75±0.17a 0.52±0.08a b 0.94±0.18a b 81.530 0.000

2.3 外周血WT1 mRNA與血清IL-6、C3、C4表達水平的相關性

急性髓系白血病初治組患者的外周血WT1mRNA與血清IL-6、C3、C4表達水平均呈正相關（P﹤0.05）。（表3）

表3 急性髓系白血病初治組患者外周血WT1 mRNA與血清IL-6、C3、C4表達水平的相關性

3 討論

急性髓系白血病是一種非淋巴細胞來源的急性白血病，發(fā)病率和病死率較高[8]。研究表明，隨著居住環(huán)境的惡化（電離輻射、化學物質等），急性髓系白血病的發(fā)病率逐年攀升[9]。有資料顯示，2014年美國新發(fā)18 860例急性髓系白血病患者，其中死亡人數(shù)為10 460例，嚴重威脅人們的身體健康和生命安全[10]。迄今為止，造血干細胞移植和化療是臨床治療急性髓系白血病的主要手段，但中國造血干細胞樣本不足，且干細胞移植費用昂貴，化療藥物的不良反應大，化療在殺死腫瘤細胞的同時，也會極大程度地抑制患者正常干細胞的造血功能和免疫功能[11]。隨著分子生物學的發(fā)展，基因診斷和靶向治療逐漸受到醫(yī)學工作者的青睞。

WT1基因是腫瘤抑制基因，于1990年由Call等[12]從Wilms瘤細胞的染色體11p13位點分離出來。WT1基因能夠編碼鋅指轉錄因子，抑制造血干細胞的增殖和分化，與惡性血液疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關[13-14]。WT1基因是白血病中常見的一種異常高表達的基因，但其高表達機制尚未完全明確。李凌浩等[15]研究表明，急性髓系白血病患者的WT1基因表達水平明顯高于非白血病患者，提示W(wǎng)T1基因在急性髓系白血病的發(fā)生、發(fā)展及預后中發(fā)揮重要作用。張熔等[16]研究表明，WT1基因在急性髓系白血病復發(fā)患兒中的表達水平明顯升高，提示W(wǎng)T1基因可以作為無染色體易位或基因融合的急性髓系白血病患兒復發(fā)的評判指標。邊志磊[17]的研究表明，在急性髓系白血病患者的骨髓細胞中，WT1基因的表達水平明顯高于非白血病患者；且WT1基因高表達患者的預后較WT1基因低表達患者差。本研究結果表明，急性髓系白血病初治組患者的WT1mRNA表達水平高于對照組，急性髓系白血病緩解組患者的WT1mRNA表達水平低于急性髓系白血病初治組，急性髓系白血病復發(fā)組患者的WT1mRNA表達水平高于急性髓系白血病初治組，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05），與上述研究結果一致。

白細胞介素（interleukin，IL）最初在白細胞中發(fā)現(xiàn)，后來在多種細胞中均能檢測到這一類細胞因子。目前發(fā)現(xiàn)的IL有38種，根據(jù)其結構的同源性分為IL-1家族、IL-6家族、IL-10家族、腫瘤壞死因子家族和造血因子家族等多個家族，IL-6基因位于人類的第7號染色體上，存在于多種細胞中，如T細胞、B細胞、內皮細胞等。IL-6是一種重要的造血調節(jié)因子，與造血干細胞和白細胞的增殖和分化密切相關。李敏敏等[18]研究表明，初診及骨髓未達完全緩解的白血病患兒中，急性髓系白血病患兒的骨髓IL-6水平高于急性淋巴細胞白血病患兒（P﹤0.05）；處于完全緩解期的不同類型白血病緩解患兒的骨髓IL-6表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）；骨髓緩解及未緩解的低、中、高?；純旱腎L-6表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；結果提示，IL-6在急性淋巴細胞白血病患者中的表達水平不會出現(xiàn)異常，但在急性髓系白血病患者中的表達水平異常升高，說明IL-6的表達水平與白血病的類型及腫瘤負荷有關。何光翠等[19]研究表明，IL-6與急性髓系白血病原始細胞的生長密切相關，可以通過調控IL-6的表達來調節(jié)急性髓系白血病原始細胞的生長。補體系統(tǒng)是天然免疫的重要組成部分，一直以來不少學者認為補體系統(tǒng)能夠有效抑制腫瘤發(fā)生。但近年來有研究表明，補體能夠分泌與腫瘤生成相關的生長因子，激活與腫瘤相關的信號通路，誘導腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[20]，但補體系統(tǒng)在急性髓系白血病患者中的作用尚未見報道。本研究結果表明，急性髓系白血病初治組患者的IL-6、C3、C4表達水平均高于對照組，急性髓系白血病緩解組患者的IL-6、C3、C4表達水平均低于急性髓系白血病初治組，急性髓系白血病復發(fā)組患者的IL-6、C3、C4表達水平均高于急性髓系白血病初治組，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05），且急性髓系白血病初治患者的外周血WT1 mRNA與血清IL-6、C3、C4表達水平均呈正相關（r=0.421，P=0.032；r=0.406，P=0.021；r=0.454，P=0.001）。提示W(wǎng)T1 mRNA、IL-6、C3、C4與急性髓系白血病的發(fā)生和發(fā)展密切相關。

綜上所述，WT1 mRNA、IL-6、C3、C4在急性髓系白血病患者中呈高表達，提示W(wǎng)T1、IL-6、C3、C4參與急性髓系白血病的發(fā)生和發(fā)展，可為急性髓系白血病的臨床診斷及靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

參考文獻

[1]莊立琨.腺苷酸環(huán)化酶9和IκBα蛋白剪切在急性髓系白血病中的作用[D].上海:上海交通大學,2014.

[2]王雪梅,葉遠馨,楊煉,等.四川地區(qū)AML1-ETO融合基因與急性髓系白血病臨床特征的相關性及預后因素分析[J].四川大學學報(醫(yī)學版),2016,47(6):931-935.

[3]張青艷.CIK細胞治療急性白血病療效的Meta分析研究[D].武漢:華中科技大學,2014.

[4]Zhao XS,Yan CH,Liu DH,et al.Combined use of WT1 and flow cytometry monitoring can promote sensitivity of predicting relapse after allogeneic HSCT without affecting specificity[J].Ann Hematol,2013,92(8):1111-1119.

[5]Yoon JH,Kim HJ,Shin SH,et al.Serial measurement of WT1 expression and decrement ratio until hematopoietic cell transplantation as a marker of residual disease in patients with cytogenetically normal acute myelogenous leukemia[J].Biol Blood Marrow Transplant,2013,19(6):958-966.

[6]高娜.急性髓系白血病Galectin-3表達及其意義[D].濟南:山東大學,2016.

[7]張之南.血液病診斷及療效標準-2版[M].北京:科學出版社,1998.

[8]張玲.急性髓細胞白血病基因異常對生存狀況的影響[D].上海:復旦大學,2013.

[9]楊秀玲.山東省某教學醫(yī)院急性髓系白血病住院費用及其影響因素研究[D].濟南:山東大學,2015.

[10]王英俏.急性髓系白血病發(fā)病因素及慢性髓性白血病TKIs早期療效評估的探討[D].濟南:山東大學,2016.

[11]吳鵬強,袁凱鋒,景莉.參芪扶正注射液聯(lián)合化療對急性髓系白血病患者療效及機體免疫功能的影響[J].中草藥,2015,46(3):401-404.

[12]Call KM,Glaser T,Ito CY,et al.Isolation and characterization of a zinc finger polypeptide gene at the human chromosome 11 Wilms’tumor locus[J].Cell,1990,60(3):509-520.

[13]Hewitt SM,Monares A,Kotickal L,et al.Regulation of the proncogenes bal-2 and c-myc by the Wilmsptumor supressor gene WT1[J].Cancer Res,1995,55:5386-5389.

[14]Baird PN,Simmons PJ.Expression of the Wilms’tumor gene(WT1)in normal hemopoiesis[J].Exp Hematol,1997,25(4):312-320.

[15]李凌浩,王智,陸時運,等.急性髓系白血病患者骨髓單個核細胞中WT1表達及其與療效、預后的關系[J].山東醫(yī)藥,2015,55(29):36-38.

[16]張熔,楊季云,廖靜,等.WT1基因和AML1-ETO融合基因表達水平在兒童急性髓細胞白血病微小殘留病監(jiān)測中的臨床意義[J].國際輸血及血液學雜志,2015,38(4):283-288.

[17]邊志磊.WT1基因在急性髓系白血病中的表達與預后的關系[D].鄭州:鄭州大學,2014.

[18]李敏敏,鄒亞偉,彭淑梅,等.白血病患兒骨髓及分離培養(yǎng)MSC的IL-6水平[J].中國輸血雜志,2015,28(5):549-552.

[19]何光翠,鄧銳,劉一嵐,等.急性白血病患者血清IFN-γ、TGF-β、IL-6和IL-17水平及臨床意義[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2017,29(6):19-21.

[20]寧昌,陳文偉,黎燕,等.補體系統(tǒng)與腫瘤的關系研究進展[J].國際藥學研究雜志,2014,41(5):516-521.