甘煌燦 賴呈純 潘紅 朱育菁

摘 要 本研究以從刺葡萄克隆獲得的DFR基因為目的基因，同時從質粒pCAMBIA1302中擴增獲得CaMV35S啟動子和NOS終止子，并利用雙酶切法構建由CaMV35S啟動子驅動DFR基因且?guī)в蠳OS終止子的表達載體，驗證測序結果顯示成功構建了pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS植物表達載體，并將該載體轉化到農桿菌EHA105中。采用農桿菌注射滲透法轉化煙草葉片進行瞬時表達，經鑒定，轉化后的煙草葉片中能檢測到GFP基因的表達。采用農桿菌介導法將該植物表達載體轉化受體茉莉花愈傷組織，經多輪抗性篩選獲得了轉基因抗性愈傷組織，經PCR鑒定，茉莉花轉基因抗性愈傷組織中檢測到GFP、Hyg和DFR基因等的存在，初步證明目的基因DFR已成功整合到宿主的基因組中。茉莉花愈傷組織遺傳轉化體系的建立，驗證了花色苷合成相關基因轉化茉莉花愈傷組織的可行性，為今后通過植物轉基因技術豐富茉莉花的花色奠定基礎。

關鍵詞 茉莉花；DFR基因；植物表達載體；愈傷組織；遺傳轉化

中圖分類號 S685.16；Q812 文獻標識碼 A

Plant Expression Vector Construction and Jasmine （Jasminum sambac （Linn.） Aiton） Callus Transformation of DFR Gene from Spine Grape （Vitis davidii Fo?x.）

GAN Huangcan1，2， LAI Chengchun1*， PAN Hong1， ZHU Yujing2

1 Institute of Agricultural Engineering and Technology， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

2 Agricultural Bioresource Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

Abstract In this experiment， DFR gene encoding dihydroflavonol 4-reductase obtained from spine grape （Vitis davidii Fo?x.） was taken as the target gene， meanwhile， the promoter CaMV35S and terminator NOS was amplified from plasmid pCAMBIA1302. Then， the plant expression vector， which inserted into DFR gene driven by promoter CaMV35S and combined with terminator NOS， was constructed by using double enzyme digestion technique. The detecting and sequencing results revealed that the plant expression vector pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS was constructed successfully. After that the vector was introduced to Agrobacterium tumefaciens EHA105. The transient expression of GFP gene in tobacco leaves was checked with A. tumefaciens EHA105 mediated transformation， and it turned out the GFP gene could be expressed. The plant expression vector pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS was introduced to jasmine calli using agrobacterium-mediated transformation. And then， the resistance jasmine calli was obtained after repeatedly resistance screening. GFP， Hyg and DFR were identified to exist in the genome of resistance jasmine calli by PCR. The preliminary evidence showed that the exogenous DFR gene was integrated into the host cell genome in jasmine calli. The feasibility of the genes related to anthocyanins synthesis introduced into jasmine genome was verified through the establishment of genetic transformation system in jasmine. This study would help build a foundation to enrich jasmine flower colors using plant transgenic technology.

Key words jasmine （Jasminum sambac （Linn.） Aiton）； DFR gene； plant expression vector； callus； genetic transformation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.014

茉莉花（Jasminum sambac （Linn.） Aiton）屬木樨科素馨屬（Jasminum） （或茉莉屬）植物[1-2]，其花香味濃厚，在花茶制作、庭園及盆栽觀賞等方面有廣泛的用途。然而，茉莉花絕大多數(shù)為白色，在人們對豐富花色的追求中處于劣勢，在市場上有諸多的局限，難以進一步推廣。在改變花色的研究中，由于傳統(tǒng)育種方法存在雜交篩選隨機性和不穩(wěn)定性等問題，人們開始積極尋求新的技術來獲得植物豐富的花色，并深入研究植物花色苷生物合成代謝的途徑[3-5]，這使得植物花色的研究進入了基因時代。但由于基因庫的有限度和基因復雜的調控，擁有全部花色譜的植物物種極其少見，多數(shù)是累積一些特異的類黃酮而展示了相對有限的花色[6-7]，如在自然條件下，由于不能合成飛燕草色素，四大鮮切花菊花、康乃馨、月季和百合均缺乏藍色花系[8]。已有研究表明，由于植物花色苷合成相關的結構基因和調控因子的異同，使得利用基因工程技術改變花色成為了可能[9]。前人已利用基因工程技術對花色改造進行了大量研究[10-14]，因此，基因工程技術已成為創(chuàng)造植物新花色的重要育種途徑。

目前，許多植物花色苷合成途徑中的關鍵酶和調控因子都已經被克隆[15-16]，其中，二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）是花青素生物合成途徑中的關鍵酶之一[17]，早在1995年，Holton等[3]就從玉米和金魚草中克隆得到DFR基因序列，并證實其調控會影響花青素的顯色作用，人們已從非洲菊[18]、葡萄[19]、小麥[20]、甜橙[21]、蔓越橘[22]、龍船花[23]、矮牽牛[24]、百合[25]、草莓[26]、楊樹[27]等許多植物中分離出DFR基因。DFR屬NADPH依賴的短鏈還原酶家族，具有二氫黃酮醇底物選擇特異性，相應的氨基酸區(qū)域決定了不同物種對底物的優(yōu)先性[28-29]，合成天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素所對應的底物分別為二氫山奈酚（DHK）、二氫槲皮素（DHQ）和二氫楊梅酮（DHM），從而使花色分別顯現(xiàn)為橙色到紅色、紅色到洋紅色、紫色到藍色的花。刺葡萄（Vitis davidii Fo?x.）為葡萄科葡萄屬的多年生木質藤本植物，有紫紅色、紅色及青色等顏色，因此其DFR基因的克隆可為其他植物的花色改造提供基因資源。本研究在成功克隆刺葡萄DFR基因[30]及對植物花色轉基因相關研究分析的基礎上，構建DFR基因植物表達載體，并探討花色苷合成相關基因轉化茉莉花愈傷組織的可行性，為今后通過植物轉基因技術改造茉莉花的花色提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

以從刺葡萄（Vitis davidii Fo觕x.）紫紅色愈傷組織[31]克隆獲得的DFR基因[30]（GenBank登錄號：KF915803）來構建植物表達載體；以煙草（Nicotiana tabacum）組培苗作為瞬時表達植物；以茉莉花愈傷組織[32]為遺傳轉化的受體材料。大腸桿菌（E. coli）DH5α購自廈門泰京生物有限公司；pACK4a-Bs載體購自盤古基因科技有限公司。采用的根癌農桿菌菌株（Agrobacterium tumefaciens）為EHA105株系，所用質粒為pCAMBIA1302，均由福建農林大學園藝植物生物工程研究所惠贈。

1.2 方法

1.2.1 DFR基因、CaMV35S啟動子和NOS終止子的克隆 DFR基因克隆參見賴呈純等[30]的方法，以pCAMBIA1302質粒的序列設計引物35S-F/35S-R和NOS-F/NOS-R，并以其為模板進行擴增，CaMV35S啟動子和NOS終止子的退火溫度分別為56、52 ℃。擴增反應結束后，取5 μL反應產物用于瓊脂糖凝膠電泳檢測?？寺〖皺z測的引物序列見表1。DFR基因、CaMV35S啟動子和NOS終止子的PCR產物回收后，與克隆載體pACK4a-Bs連接，然后轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取白斑搖菌后，送鉑尚生物技術有限公司測序驗證。

1.2.2 植物表達載體構建與轉化 將質粒pACK4a-35S與pCAMBIA1302載體進行EcoR I/Kpn I雙酶切后，再進行連接，獲得pCAMBIA1302-35S質粒；然后再將pACK4a-DFR與pCAMBIA1302-35S質粒進行Kpn I/Xba I雙酶切，連接后獲得pCAMBIA1302-35S-DFR質粒；最后將pACK4a-NOS與pCAMBIA1302-35S-DFR質粒進行Xba I/Hind III雙酶切，獲得pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS載體。以上步驟中，連接均用T4 DNA ligase連接酶16 ℃過夜并轉化于大腸桿菌DH5α中進行擴增。構建成功后進行雙酶切及PCR檢測。將重組質粒pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS通過凍融法導入農桿菌EHA105。

1.2.3 煙草的瞬時表達 以煙草組培苗為待試煙草植株。利用農桿菌注射滲透法轉化煙草葉片，參照孫蔓莉等[33]的方法進行。

1.2.4 茉莉花愈傷組織轉化 茉莉花愈傷組織抗生素敏感性試驗參照匡云波等[34]的方法并適當改進，將生長良好的茉莉花型愈傷組織分別培養(yǎng)于添加有不同濃度的抑菌性抗生素頭孢霉素（0、100、200、300、400 mg/L）和選擇性抗生素潮霉素（0、5、10、15、20 mg/L）的培養(yǎng)基中，于23～25 ℃光照下培養(yǎng)14 d，觀察頭孢霉素和潮霉素對茉莉花愈傷組織生長的影響。

茉莉花愈傷組織與農桿菌共培養(yǎng)：挑取轉化的農桿菌EHA105單菌落，接種于3 mL含50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，再按1%接種量將菌液轉移到新鮮的含有相應抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD=0.5（3～4 h，可適當延長）。將培養(yǎng)好的菌液在5 000 r/min條件下離心5 min，收集菌體并將菌體重懸于1/2體積的重懸液M2，于28 ℃、120 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4～6 h用于侵染。將茉莉花愈傷組織的四周切出傷口，接種于預處理培養(yǎng)基M3中高滲處理4～5 h。然后取出愈傷組織于無菌濾紙上風干20 min待侵染。將預處理過的愈傷組織轉入上述菌液中，于25 ℃、80 r/min條件下振蕩30 min，取出愈傷組織后用無菌濾紙吸干多余的菌液，然后轉入共培養(yǎng)基M4中，于室溫（24±1）℃、光照條件下培養(yǎng)2～3 d。

抗性愈傷組織的篩選：共培養(yǎng)后，先用無菌水將橫切薄片清洗3～5次，然后用含300 mg/L頭孢霉素的無菌水清洗2次，靜置30 min。轉入第一輪篩選培養(yǎng)基M5中，于28 ℃下，暗培養(yǎng)7 d左右直至愈傷組織恢復生長。然后于光照下培養(yǎng)10～15 d，光照時間為16 h/d。將第1輪篩選后所得抗性愈傷組織轉接到第2輪篩選培養(yǎng)基M6中，進一步篩選抗性愈傷組織，每14 d更換一次培養(yǎng)基，共進行3～4批篩選。

綠色熒光和PCR檢測：利用熒光體式顯微鏡觀察篩選獲得的茉莉花抗性愈傷組織中報告基因GFP的表達情況。同時，取適量的抗性愈傷組織提取DNA，并以未轉化的茉莉花愈傷組織DNA作為對照，DNA提取后稀釋成一致濃度。用來檢測目的基因DFR、抗性基因Hyg及報告基因GFP是否成功導入茉莉花愈傷組織。

1.2.5 培養(yǎng)基 本試驗所用培養(yǎng)基配方及成分如表2所示。

2 結果與分析

2.1 刺葡萄愈傷組織DFR基因、CaMV35S啟動子和NOS終止子的分離

經PCR擴增TA克隆后，獲得DFR基因的ORF區(qū)，目的片段大小為1.2 kb左右（圖1-A）。同時，經PCR擴增TA克隆后，獲得CaMV35S啟動子和NOS終止子片段，分別為600、300 bp左右（圖1-B、C）。并回收TA克隆產物，獲得克隆載體質粒pACK4a-DFR、pACK4a-35S和pACK4a-NOS。

A： DFR gene； B： CaMV35S； C： NOS； M： 100 bp Plus II DNA ladder Marker.

圖1 DFR基因、CaMV35S啟動子和NOS終止子PCR

擴增產物

Fig. 1 PCR products of DFR， CaMV35S and NOS

2.2 植物表達載體構建

將pACK-35S質粒與pCAMBIA1302載體進行EcoR I/Kpn I雙酶切后，用T4 DNA ligase進行連接，獲得pCAMBIA1302-35S質粒；然后再將pACK4a-DFR質粒與pCAMBIA1302-35S質粒進行Kpn I/Xba I雙酶切，連接后獲得pCAMBIA1302-35S-DFR質粒；再將pACK4a-NOS與pCAMBIA1302-35S-DFR質粒進行Xba I/Hind III雙酶切，連接獲得pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS載體（圖2）。最后轉化大腸桿菌DH5α，質粒擴增后，提取質粒進行PCR和雙酶切驗證（圖3-A、B），并測序驗證。驗證結果表明，含刺葡萄DFR基因的植物表達載體已成功構建。

2.3 植物表達載體轉化農桿菌EHA105

將攜帶刺葡萄DFR基因的植物表達載體轉化農桿菌EHA105感受態(tài)細胞，經擴增培養(yǎng)后進行PCR檢測，結果見圖4，NptII抗性基因、GFP熒光標記基因的片段長度均為在700～800 bp左右，而DFR基因和35S-DFR片段的長度分別為1.2、1.8 kb左右。這與預計的目的片段長度一致，因此，判斷此4條特異性DNA條帶即為目標DNA條帶，這表明目的質粒已經轉化農桿菌EHA105。

2.4 煙草瞬時表達及GFP檢測

利用農桿菌注射滲透法轉化煙草葉片檢測質粒載體pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS瞬時表達。在488 nm波長的藍色激發(fā)光下，觀察注射后的煙草葉片的表皮（取多個重復），結果發(fā)現(xiàn)煙草的表皮發(fā)出明亮的綠色熒光，并且綠色熒光在葉脈四周有清晰地分布，而其他部位也檢測到綠色熒光并呈現(xiàn)均勻分布，如圖5所示。持續(xù)的觀察表明，在農桿菌侵染后1 d未見GFP表達，直到侵染后2 d才開始表達，并且在3 d達到最大值，4～6 d保持不變，一周后熒光出現(xiàn)下降趨勢。這表明構建的質粒載體pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS可在煙草葉片中瞬時表達。

2.5 茉莉花愈傷組織的抗生素敏感性試驗

2.5.1 頭孢霉素敏感性試驗 在其他培養(yǎng)條件一致的情況下，將茉莉花愈傷組織接種于含有不同濃度頭孢霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察愈傷組織的生長情況（圖6-A～D）。觀察結果表明，頭孢霉素濃度在100～400 mg/L范圍內，茉莉花愈傷組織生長率均為100%。這說明不同濃度的頭孢霉素對茉莉愈傷組織生長的影響不明顯，不會抑制其生長。此外，觀察結果還可看出，在添加頭孢霉素后，愈傷組織的顏色明顯變深，且隨著頭孢霉素濃度的升高，茉莉花愈傷組織的生長速度呈下降趨勢。綜合考慮愈傷組織的生長和遺傳轉化，以頭孢霉素濃度400 mg/L作為篩選時抑制農桿菌EHA105生長的濃度。

2.5.2 潮霉素敏感性試驗 將茉莉花愈傷組織接種于含有不同濃度潮霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其生長情況的觀察記錄見表3和圖6-E～H。由表3可知，茉莉花愈傷組織對潮霉素很敏感，在潮霉素濃度為5 mg/L

時很明顯地抑制愈傷組織的生長，愈傷組織生長率為50%；而在10 mg/L時，其愈傷組織生長率為3.33%；在更高濃度（15、20 mg/L）時，其褐變率達到了100%。因此，可先以5 mg/L潮霉素進行茉莉愈傷組織的預篩選，然后再逐漸增加潮霉素的濃度逐步篩選。

2.6 茉莉花愈傷組織轉化

2.6.1 茉莉愈傷組織的轉化與抗性篩選 茉莉花愈傷繼代培養(yǎng)時，一般需要5～7 d來適應新的培養(yǎng)環(huán)境后才恢復生長。農桿菌侵染茉莉花愈傷組織后，一開始就采用較高濃度抗生素（潮霉素）的篩選培養(yǎng)基，容易導致轉化材料褐變死亡，較難得到良好的愈傷組織。而采用逐步提高潮霉素選擇壓，有利于茉莉花抗性愈傷組織的獲取。從觀察的統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析可看出，經與農桿菌EHA105共培養(yǎng)后的茉莉花愈傷組織，轉接到M5培養(yǎng)基中進行第1輪培養(yǎng)，第1輪培養(yǎng)篩選后愈傷組織的成活率在46.67%～56.67%之間，說明在較低潮霉素濃度的篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d左右有利于轉化后茉莉花愈傷組織生長的恢復。挑取第1輪篩選后恢復生長且生長狀態(tài)較好的茉莉花愈傷組織，轉到M6培養(yǎng)基中進行第2輪篩選，培養(yǎng)14 d后進行統(tǒng)計，抗性愈傷組織的成活率較高，平均可達66.67%左右，隨后再將獲得的茉莉花愈傷組織反復轉接到M6培養(yǎng)基中篩選3～4次，有部分茉莉花愈傷組織逐漸出現(xiàn)褐化死亡，說明假陽性在連續(xù)的篩選培養(yǎng)中逐漸被剔除，最終獲得生長較一致的茉莉花抗性愈傷組織。

2.6.2 抗性愈傷組織GFP基因表達的檢測 在熒光體式顯微鏡下，圖7是檢測篩選多代后獲得的茉莉花抗性愈傷組織。從圖7可看出，茉莉花的抗性愈傷組織是由轉化和非轉化細胞團混合共生的，未轉化細胞團未發(fā)出熒光，而轉化細胞團則發(fā)出較強的綠色熒光（圖7-A、B）。同時對愈傷組織進行切片處理，獲得單細胞切片，未轉化的細胞未見有自發(fā)綠色熒光，而轉化細胞可清楚觀察到自發(fā)綠色熒光的存在（圖7-C）。雖然發(fā)光強度有所不同，但約90%的抗性細胞都發(fā)出可檢測的綠色熒光，并且細胞壁和細胞膜的亮度較強。這充分說明經過抗性篩選后已獲得了茉莉花轉基因愈傷組織。

2.6.3 抗性愈傷組織的PCR檢測 選取生長良好的、適量的茉莉花轉基因愈傷組織提取DNA，并進行目的基因DFR、35S-DFR、熒光基因GFP、抗性基因Hgy的PCR檢測，以未轉化的茉莉花愈傷組織作為對照，PCR擴增結果見圖8。從圖8可看出，目的基因DFR和抗性基因Hyg在未轉化的愈傷組織中有微弱的表達，而經遺傳轉化的茉莉花抗性愈傷組織，其表達有顯著的增強，重復3次的PCR擴增結果均證明了這一點。從報告基因GFP和重組片段35S-DFR擴增的結果看，在未轉化的茉莉花愈傷組織未擴增出預期片段，但其在茉莉花抗性愈傷組織中卻有顯著的表達，一是重組目的片段35S-DFR的PCR電泳圖中出現(xiàn)了大小為1.8 kb左右的目的條帶，二是報告基因GFP的PCR電泳圖中出現(xiàn)了大小為700 bp左右的目的條帶，這與預計的2個片段條帶大小相符。綜上所述，初步證明包含目的基因DFR的質粒已成功整合到茉莉花愈傷組織基因組中，但有待進一步的分子生物學分析。

3 討論

3.1 茉莉花轉化DFR基因的價值

茉莉花用途廣泛。然而，茉莉花花色單一，絕大多數(shù)為白色，極大影響了其觀賞價值。已有研究表明，茉莉在自然條件下結實率很低，雙瓣茉莉自然結實率僅為0.19%[35]，并且種子在自然條件下難以萌發(fā)，實踐中很多種植了10多年的農戶未見過茉莉花種子和由種子自然萌發(fā)而長成的茉莉花實生苗。這使得利用傳統(tǒng)的育種方法來改良茉莉花性狀或進行花色改造存在巨大的困難。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，基因工程技術為花卉的改良提供了全新的思路，轉基因技術已廣泛應用于植物花色改造[11-14]。二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）是花青素合成途徑過程中的關鍵酶之一[29， 36]，并且該基因在植物花色基因工程中已有應用[37-38]，本研究以該基因為重組的外源基因進行研究，具有較強的理論意義和實用價值。

3.2 潮霉素相關問題探討

在茉莉花抗性愈傷組織的PCR驗證中，在未轉化的茉莉花愈傷組織中檢測到Hyg基因的極微弱表達，通過查詢相關的文獻，其原因可能是PCR反應體系存在污染，而且這種污染是比較難去除的。但從茉莉花愈傷組織對潮霉素敏感性試驗中，茉莉花愈傷組織對潮霉素反應敏感，這與許多前人的研究結果類似[39-40]。濃度為5 mg/L的潮霉素對茉莉花愈傷組織生長就有較強烈的抑制，10 mg/L的潮霉素有強烈的抑制作用，這從側面說明了茉莉花愈傷組織中不存在潮霉素基因。從茉莉花轉基因愈傷組織Hyg基因PCR檢測中，其3次重復的電泳條帶的亮度均比未轉化的茉莉花愈傷組織強，初步說明重組質粒已經成功整合到茉莉花的基因組中。

3.3 瞬時表達與抗性愈傷組織篩選

本研究中，在農桿菌侵染煙草瞬時表達時，觀察發(fā)現(xiàn)在侵染3 d后，GFP的亮度達到最大，而在一周后出現(xiàn)下降趨勢，這與莫倩珍等[41]在研究煙草的快速高效表達中所發(fā)現(xiàn)的GFP基因表達趨勢相似。在抗性愈傷組織的篩選上，可參考匡云波等[34]的研究，篩選時需要一段時間的恢復培養(yǎng)，并從低濃度的培養(yǎng)基進行篩選，可減少轉化材料的褐變死亡，經過2輪的篩選后，假陽性逐漸被剔除，抗性愈傷的成活率平均可達66.67%左右。通過體式鏡檢測篩選后的抗性愈傷組織，發(fā)現(xiàn)愈傷組織塊和單個細胞均發(fā)出強烈的綠色熒光。通過PCR檢測目的基因、抗性基因和GFP基因，并結合GFP熒光蛋白檢測，初步表明目的基因已整合到茉莉花愈傷組織基因組中，但有待進一步的分子生物學分析。

由于茉莉花愈傷組織再生植株的難題還未克服，未能獲得轉基因植株，目前相關的試驗還在進一步研究中。但本試驗成功構建了刺葡萄DFR基因的植物表達載體pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS，采用農桿菌介導法將該載體導入茉莉花愈傷組織中，經多輪篩選獲得茉莉花轉基因抗性愈傷組織。PCR檢測結果初步證明，目的基因DFR已成功整合到宿主的基因組中，成功建立了茉莉花轉基因愈傷組織遺傳轉化體系。本研究驗證了花色苷合成相關基因轉化茉莉花愈傷組織的可行性，為通過植物轉基因技術創(chuàng)造豐富的茉莉花花色奠定了基礎。

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