Muhammad Naeem Asghar

摘要 [目的]研究細莖石斛多糖的最佳提取條件及其抗氧化活性。[方法]通過單因素試驗和響應(yīng)面分析，研究細莖石斛多糖（DMP）的最佳提取條件。通過體外試驗評價細莖石斛多糖的體外抗氧化活性。[結(jié)果]在料液比為1∶53，時間為3 h，溫度為83 ℃的提取條件下，DMP最高產(chǎn)量可達185 mg/g。體外抗氧化活性研究結(jié)果表明，DMP對超氧陰離子自由基、ABTS自由基、羥基自由基具有明顯的清除作用，其中對ABTS自由基清除能力與維生素C相當；DMP對DPPH自由基的清除能力和還原能力效果比較適中。[結(jié)論]該研究揭示細莖石斛多糖可以作為一種天然抗氧化劑，為基于多糖的藥物及保健食品的開發(fā)提供新思路。

關(guān)鍵詞 細莖石斛；多醣；最佳提取條件；抗氧化活性

中圖分類號 S-3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）20-0001-05

Abstract [Objective] The research aimed to study the optimal extraction conditions and antioxidant activity of polysaccharide from Dendrobium monliforme.[Method] Through singlefactor tests and response surface analysis， the optimal conditions for extraction of polysaccharide from Dendrobium monliforme were studied. The antioxidant activity of polysaccharide from Dendrobium monliforme was evaluated in vitro.[Result]The maximum yield obtained 185 mg/g at solidliquid ratio 1∶53， time 3 hours and temperature 83 ℃.The results of in vitro antioxidant activity showed that DMP had obvious scavenging effects of superoxide anion radical， ABTS radical， hydroxyl radical，while moderate scavenging effects of DPPH radical. In addition， ABTS radical scavenging activity of DMP was as stronger as vitamin C. [Conclusion]This polysaccharide could be developed as a new source of natural antioxidants， polysaccharide-based drugs or food ingredients with specific health improving functions.

Key words Dendrobium moniliforme；Polysaccharide；Optimal extraction conditions；Antioxidant activity

細莖石斛[Dendrobium moniliforme （L.） Sw.]為蘭科石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物，其莖是藥用石斛的重要來源，具有滋陰養(yǎng)胃、益氣潤肺、潤陰生津、清腦明目、益壽延年等功效，對咽喉疾病、腸胃疾病、白內(nèi)障、心血管疾病、糖尿病和抑制腫瘤生長具有顯著療效[1]。石斛的藥用成分主要是多糖，在石斛多糖的作用下，能夠顯著提高人體內(nèi)超氧化歧化酶（SOD）含量，降低過氧化脂質(zhì)（LPO）對人體的作用，清除體內(nèi)自由基[2-3]。而且，石斛多糖還有抗激素、抗前列腺、抗腫瘤等功能活性[4-6]。但是，目前尚缺少有關(guān)細莖石斛多糖的最佳提取條件和體外抗氧化活性方面的研究。筆者基于Box-Behnken設(shè)計，采用響應(yīng)面法（RSM）優(yōu)化細莖石斛的水溶性多糖的提取條件，并研究多糖的抗氧化活性，以期為其應(yīng)用開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 細莖石斛原材料采集于安徽省。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗設(shè)計。

通過單因素試驗分析提取溫度、提取時間和料液比對DMP產(chǎn)率的影響。在優(yōu)化試驗因素期間，改變其中一個因素，而其他因素在每個試驗中保持不變。試驗設(shè)計5個料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，選擇5個提取時間分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h，提取溫度分別設(shè)計在20、40、60、80、100 ℃。

1.2.2 Box-Behnken設(shè)計。

根據(jù)單因素試驗設(shè)計，確定提取變量的范圍。根據(jù)Box-Behnken設(shè)計，將它們作為提取多糖的因子，并進行了17次隨機試驗以確定最佳水平。設(shè)計的5個重復(fù)用于估計誤差平方和。所有試驗進行3次，提取糖的平均含量作為響應(yīng)。通過初步的單因素試驗確定變量的水平。表1中顯示了變量的實際值和編碼值，選擇用于試驗的3個因素X1、X2和X3，分別表示高、中、低值，編碼分別為+1、0和-1。

響應(yīng)曲面曲線可以預(yù)測變量的最佳水平，實現(xiàn)多糖的最大產(chǎn)量?；貧w模型的重要性通過每個反應(yīng)的方差分析（ANOVA）來檢驗。R2、調(diào)整R2、 預(yù)測R2顯示擬合指數(shù)的質(zhì)量，通過P值發(fā)現(xiàn)模型中的重要變量。另外，比較每個自變量的實驗值和預(yù)測值（表2）。

1.2.3 細莖石斛多糖的提取。根據(jù)提取參數(shù)將干燥的細莖石斛粉末用蒸餾水提取3次，3次提取物合并，將合并的提取物過濾，收集上清液，以10 000 r/min離心10 min，并將濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。將該物質(zhì)冷卻至室溫，并以1∶4（V/V）的比例緩慢加入95%乙醇，同時迅速攪拌，于室溫放置過夜[7]。乙醇沉淀后，通過Sevag的方法進行脫蛋白[8]。然后，將提取物以8 000 r/min離心10 min后，并用冷凍干燥機進行干燥，最終得到細莖石斛粗多糖（DMP），用于測定抗氧化活性的研究。

1.2.4 體外抗氧化活性測定。

1.2.4.1 DPPH自由基清除活性測定。根據(jù)Gao等[9]方法稍作修改，測定DMP對DPPH自由基的清除活性。2 mL不同濃度的多糖樣品（0.5、 1.0、 2.0、4.0和8.0 mg/mL）和2 mL的DPPH-乙醇溶液（0.16 mmol/L）混勻后在25 ℃下溫育15 min，然后在525 nm處測量吸光度。使用相同濃度抗壞血酸（VC）代替樣品作為陽性對照。通過以下公式計算樣品的DPPH自由基清除活性。

1.2.4.2 超氧自由基清除活性測定。

DMP對超氧自由基的清除活性是根據(jù)He等[10]的方法并稍作修改。取pH 8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL，在25 ℃水浴中預(yù)熱20 min。1 mL不同濃度的多糖溶液（0.5、 1.0、 2.0、4.0 和8.0 mg/mL）中依次加入0.4 mL （25 mmol/L）的焦性沒食子酸，并劇烈混合，在25 ℃反應(yīng)5 min，并用1 mL（8 mol/L）鹽酸終止反應(yīng)，測定吸光度為A1。使用相同的測定程序，其中蒸餾水代替多糖和焦性沒食子酸測定吸光度為A2，焦性沒食子酸代替多糖測定吸光度為A3，蒸餾水代替焦性沒食子酸測定吸光度為A4。在325 nm處測量吸光度，通過以下公式以樣品的清除率評估樣品的清除超氧化物自由基活性。

超氧陰離子自由基清除率=[A3（A1A4）-A2]×100%

1.2.4.3 ABTS自由基清除試驗。ABTS+試驗溶液的配制是將5.0 mL （7 mmol/L） ABTS+和 2.88 μL （2.45 mmol/L）過硫酸鉀的混合而成，并在室溫下溫育16 h。在使用時，ABTS+溶液用去離子水稀釋后，在 734 nm處測得吸光度為0.70±0.02可用。將0.1 mL不同的濃度（0.5、 1.0、 2.0、4.0 和8.0 mg/mL）的多糖樣品加入到1 mL的ABTS+溶液中并混合均勻。將樣品溶液在室溫下放置6 min進行反應(yīng)， 使用抗壞血酸（VC）作為陽性對照，立即在734 nm處測量吸光度。在空白對照中， 樣品用蒸餾水代替。ABTS+清除率通過以下公式計算。

1.2.4.4 羥基自由基清除試驗。

根據(jù)He等[10]的方法測量羥基自由基的清除活性。1 mL不同濃度的多糖樣品溶液（0.5、 1.0、 2.0、4.0 和8.0 mg/mL）、 l mL（9 mmol/ L）硫酸亞鐵和1 mL（9 mmol/ L）水楊酸乙醇溶液，于37 ℃混合反應(yīng)30 min。用蒸餾水作為參考，在510 nm處測量吸光度。考慮到多糖本身的吸光度，將用8.8 mmol/L H2O2替代多糖測定吸光度。通過下面公式評估樣品的抗氧化活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素分析

2.1.1 料液比對細莖石斛多糖提取率的影響。

從圖1可看出，在固定的提取時間3 h 和溫度80 ℃時，隨著料液比從1∶20增加至1∶50，提取產(chǎn)率逐漸增加，當料液比為1∶50提取率達到最高值。料液比超過1∶50時，提取率會顯著降低。原因可能是水與原料的較大比例意味著內(nèi)部植物細胞與外部溶劑之間的濃度差異較大，從而使材料中進入更多的多糖分子[11]?？梢姼弑嚷士梢苑催^來降低提取率。因此，該試驗中1∶50被認為是水與原料的最佳比例。

2.1.2 提取時間對DMP提取率的影響。

在水與原料的比例為1∶50，提取溫度為80 ℃時，對不同提取時間對提取率的影響進行考察。從圖2可以看出，在最初的3 h期間，提取產(chǎn)率顯著增加，然而隨著時間進一步增加，產(chǎn)率會降低。這可能是由于加熱效應(yīng)和過度較長的提取時間，使多糖的結(jié)構(gòu)遭到破壞和分解[12]。提取率在3 h前與提取時間成正比，3 h后沒有顯著增加。因此，最佳提取時間設(shè)定為3 h。

2.1.3 提取溫度對DMP提取率的影響。

提取溫度對DMP提取率的影響見圖3， 而提取時間和料液比分別固定為3 h和1∶50。當提取溫度從20 ℃升高到80 ℃時，提取率迅速增加，隨著溫度的進一步升高，提取率有所下降。這種趨勢可能是由于高溫提高了多糖的擴散系數(shù)，提高了多糖在提取溶劑中的溶解度，導(dǎo)致多糖物質(zhì)從物料中流出到提取液中[13]。然而，較高的溫度可能會促進多糖化合物的降解反應(yīng)。因此，該試驗選擇的最佳提取溫度為80 ℃。

2.2 Box-Behnken分析

2.2.1 DMP提取條件的優(yōu)化。

經(jīng)計算，所得模型中的F值

為13.47，這意味著該模型是顯著的。相對于純粹的誤差，失擬值0.23并不顯著。檢測方程回歸系數(shù)的顯著性結(jié)果表明，多糖產(chǎn)量受線性項X1、X2、X3、X2X3、X22、X32影響顯著。P值是顯著的，因為它們低于預(yù)期的 R2（0.799 6）與調(diào)整R2（0.875 2）合理，所以該模型可用。

通過使用Design Expert軟件繪制響應(yīng)曲面來研究2個參數(shù)之間的相互作用并確定最大DMP產(chǎn)量的最佳條件。3D響應(yīng)面和2D輪廓圖如圖4和圖5所示。每幅圖顯示了2個變量對DMP產(chǎn)量的影響，而另一個固定在0水平。輪廓圖的不同形狀表示變量之間的不同相互作用。

響應(yīng)曲面曲線（圖4～5）反映了變量與DMP多糖產(chǎn)量之間的定量關(guān)系。隨著料液比、提取時間和提取溫度的升高，

多糖產(chǎn)量逐漸增加。當料液比增加時，可以將多糖產(chǎn)量從120 mg/g提高至183 mg/g。隨著料液比增加，較高的溫度也可以增加多糖的產(chǎn)量。但料液比超過1∶50或提取時間超過3 h或提取溫度超過80 ℃時，多糖產(chǎn)量將下降，并分別在響應(yīng)面上得到峰值。在一定范圍內(nèi)，較長的提取時間和較高的溫度將顯著提高多糖產(chǎn)量。

2.2.2 驗證預(yù)測模型。

從回歸方程得到DMP最大產(chǎn)量的最佳提取條件為料液比1∶53、提取時間3 h、提取溫度83 ℃。在最佳提取條件下，試驗DMP產(chǎn)量為185 mg/g，與預(yù)測值相符，表明響應(yīng)模型可用于優(yōu)化DMP提取過程。因此，可以確定DMP多糖的最佳提取條件是料液比1∶53、提取時間3 h、提取溫度83 ℃，多糖產(chǎn)量可以達185 mg/g。

2.3 多糖的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除活性。

DPPH是具有質(zhì)子自由基的重要化合物，一旦接觸質(zhì)子自由基清除劑會使其含量極大減少。目前，許多研究表明，從植物中分離出的多糖能夠清除自由基，因此可以歸類為天然抗氧化劑[14-16]。從圖6可看出，0.5、1.0、2.0、4.0 和 8.0 mg/mL的DMP對DPPH自由基清除能力分別為2.35%、8.79%、18.99%、33.28%和49.29%。在相同濃度0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/mL下，VC的清除活性分別為88.00%、91.52%、91.99%、92.60%和92.40%，可見當VC濃度增加到8.0 mg/mL其清除率有所降低。細莖石斛多糖溶液以劑量依賴的方式對DPPH自由基產(chǎn)生清除作用，但在相同濃度下其作用稍低于VC。因此，DPPH清除率隨著DMP濃度的增加而增加，進一步揭示DMP可以提供氫原子并對DPPH自由基發(fā)揮強有力的清除活性。

2.3.2 超氧自由基清除活性。

超氧化物自由基是具有高毒性的活性氧物質(zhì)，可以轉(zhuǎn)化為有害的物質(zhì)，如過氧化氫、羥基自由基和破壞性生物分子，導(dǎo)致慢性疾病。過氧化物陰離子自由基由酶系統(tǒng)產(chǎn)生，如過氧化物酶、NADPH氧化酶和黃嘌呤氧化酶[17-18]。盡管超氧陰離子在大多數(shù)生物體中是由線粒體電子系統(tǒng)產(chǎn)生的自由基。它可以很容易地與其他分子反應(yīng)并形成更強的活性氧和次生自由基，如羥基自由基、過氧化氫和單線態(tài)氧，然后可能導(dǎo)致各種疾病如炎癥、癌癥和神經(jīng)變性。因此，超氧陰離子自由基的清除對抗氧化非常重要。最近研究證實，特定的天然多糖表現(xiàn)出顯著的清除超氧陰離子自由基的活性[19]。

從圖7可看出，DMP以劑量依賴性方式對超氧陰離子自由基發(fā)揮明顯的清除活性，特別是當DMP的濃度為4.0和8.0 mg/mL時，其清除率分別為41.21%和65.60%。而較低濃度（0.5～2.0 mg/mL）的DMP溶液顯示出較低的清除活性。表明DMP可清除超氧化物陰離子自由基，特別是在高濃度時。

2.3.3 ABTS自由基清除試驗。

ABTS分析經(jīng)常用于評估單種化合物和各種植物的復(fù)雜混合物的總抗氧化能力[20-22]。為了研究DMP的抗氧化能力，對ABTS自由基清除活性進行測定。ABTS可以被氧化劑氧化產(chǎn)生亞穩(wěn)態(tài)自由基陽離子的過氧化物酶底物，作為反映提取多糖的抗氧化活性的指標[23]。在該測定中，在過硫酸鉀存在下的ABTS被轉(zhuǎn)化為自由基陽離子（在734 nm處具有吸光度）。當與抗氧化劑反應(yīng)時，藍色ABTS自由基陽離子變?yōu)闊o色。因此，抗氧化能力越高，在734 nm處吸光度越小[22]。

從圖8可看出，DMP多糖樣品對ABTS自由基的清除活性隨著濃度的升高而增加。不同濃度的DMP多糖（0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/mL）和VC的清除能力分別為5.05%、23.77%、48.73%、73.35%、95.62%和99.16%、98.99%、99.16%、99.32%、100.00%。當濃度為8.0 mg/mL時，DMP多糖表現(xiàn)出與VC幾乎相同的清除活性，僅比VC低4.38%。表明DMP對ABTS自由基具有很強的清除能力，可以作為潛在的抗氧化劑進行探索。

2.3.4 羥基自由基清除活性。

羥基自由基（·OH）被認為是一種強大的氧化劑，可嚴重損害生物分子[24]?！H是最具反應(yīng)活性和有害的活性氧物質(zhì)之一，可以輕易地攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，導(dǎo)致細胞死亡和組織損傷。因此，去除羥基對保護生命系統(tǒng)非常重要[25]。

從圖9可看出，DMP樣品對·OH的清除效果呈劑量依賴性，0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/mL的DMP樣品對·OH的清除率分別達到45.35%、56.46%、70.16%、77.18%和80.29%；DMP對·OH的清除作用非常接近VC。表明在以VC為陽性對照下，DMP多糖可以劑量依賴性方式清除·OH，進一步驗證DMP多糖可作為潛在抗氧化劑。

3 結(jié)論

綜合以上研究結(jié)果，可得到DMP最佳的提取條件為料液比1∶53、提取時間3 h、提取溫度83 ℃，在這種提取條件下，DMP的最大產(chǎn)量可達到185 mg/g。而且，DMP表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性。因此，DMP可作為功能性食品中的天然抗氧化劑。

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