芮聰杰　潘孝成　沈?qū)W懷

摘要豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的豬急性高度接觸性腸道傳染病，主要臨床癥狀表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、脫水等。近年來，PED在全球范圍內(nèi)暴發(fā)流行，使養(yǎng)豬業(yè)遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)豬流行性腹瀉的檢測(cè)方法（病毒的分離和鑒定、免疫電鏡法、免疫學(xué)檢測(cè)法、分子生物學(xué)檢測(cè)等）進(jìn)行了綜述，以期對(duì)豬流行性腹瀉病毒的防控提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞豬流行性腹瀉病毒；檢測(cè)技術(shù)；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)S852.65+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2018）25-0022-04

Research Progress on the Detection Technique of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

RUI Congjie1，2，PAN Xiaocheng1，SHEN Xuehuai1 et al

（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Anhui Academy of Agricultural Science，Hefei，Anhui 230031；2.College of Animal Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei，Anhui 230061）

AbstractPorcine epidemic diarrhea （PED），caused by porcine epidemic diarrhea virus （PEDV），is a highly contagious，acute enteric viral disease of swine characterized by vomiting，watery diarrhea，dehydration and death.In recent years，swine epidemic diarrhoea has become a global epidemic.As a result，the pig industry has suffered huge economic losses.This paper reviewed the methods to detect PEDV，such as isolation and identification of PEDV，immunoelectron microscopy methods，immunological methods and methods in molecular biology，so as to provide theoretical basis for prevention and control of porcine epidemic diarrhea virus .

Key wordsPorcine epidemic diarrhea virus；Detection technique；Research progress

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬急性高度接觸性腸道傳染病，主要表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、脫水等特征[1-2]。各年齡豬只均可發(fā)病，但以10日齡以內(nèi)哺乳仔豬的病死率最高。該病最早于1971年在英格蘭豬群中首次發(fā)現(xiàn)[3]。 1982年，比利時(shí)Pensaert等[4]分離出不同于傳染性胃腸炎的病毒，將其命名為類冠狀病毒CV777株； 隨后英國(guó)、德國(guó)、捷克、匈牙利等國(guó)家相繼報(bào)道有該病的發(fā)生。20世紀(jì)80年代，日本、韓國(guó)、泰國(guó)等亞洲國(guó)家也陸續(xù)有該病的報(bào)道。我國(guó)于1973年首次報(bào)道出現(xiàn)PEDV的感染，并于1982年分離該病毒獲得成功[5]。自2010 年底以來，我國(guó)大部分地區(qū)暴發(fā)了由PEDV變異毒株引起的腹瀉，此次疫情的臨床癥狀較為嚴(yán)重，初生仔豬的病死率可達(dá)90%[6]，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，該病在全球肆虐，美國(guó)、墨西哥、臺(tái)灣、日本、加拿大、多米尼加共和國(guó)、哥倫比亞、秘魯、韓國(guó)、烏克蘭等國(guó)家和地區(qū)也相繼暴發(fā)豬流行性腹瀉疫情[7-8]，給各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重?fù)p失，是近年來全球養(yǎng)豬業(yè)關(guān)注的疫病焦點(diǎn)。筆者對(duì)豬流行性腹瀉病毒的檢測(cè)方法（包括病毒的分離鑒定、免疫電鏡法、免疫學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)等）進(jìn)行了綜述，以期對(duì)豬流行性腹瀉病毒的防控提供理論依據(jù)。

1病毒分離與鑒定

PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，核酸基因組為單股正鏈RNA囊膜病毒[7]。1982年，宣華等[5]以吉林分離毒株在胎豬腸組織原代單層細(xì)胞培養(yǎng)物中分離PEDV獲得成功。1988年，瑞典學(xué)者Hofmann等[8]成功在Vero細(xì)胞中培養(yǎng)PEDV，并發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入胰酶有利于PEDV在Vero細(xì)胞的增殖。孫瑩[9]從江蘇省某大規(guī)模豬場(chǎng)感染PEDV的哺乳仔豬小腸內(nèi)容物樣品中分離到JSX2014毒株，接種Vero細(xì)胞產(chǎn)生的CPE病變明顯，但此病變特征與PEDV經(jīng)典株CV777在細(xì)胞上產(chǎn)生的大空泡、細(xì)胞融合及多核細(xì)胞等病變特征不一致。此毒株的第55代已達(dá)到TCID50為10-4.71/mL，與2010年底以來國(guó)內(nèi)PEDV分離株的親緣關(guān)系較近，與經(jīng)典毒株CV777等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，為新型G2b型變異株。卓秀萍[10]利用Vero細(xì)胞分離出EM-P株，屬于G1-1亞型，與CV777株、韓國(guó)、日本、泰國(guó)等其他國(guó)家的流行毒株及2010年前的中國(guó)毒株處于同一亞群，經(jīng)測(cè)定病毒的TCID50為10-5.5/mL。利用Vero細(xì)胞培養(yǎng)并加入一定濃度的胰酶分離PEDV毒株已成為使用最多的方法，添加胰酶的濃度從2.5 μg/mL到60 μg/mL不等。潘溪[11]用未添加胰酶的維持液成功分離出一株SH6變異毒株，證實(shí)在培養(yǎng)PEDV的Vero細(xì)胞中可以不添加胰酶。Shirato等[12]研究表明，沒有胰酶，PEDV可以在Vero細(xì)胞上增殖，但病毒釋放入培養(yǎng)液被強(qiáng)烈抑制。培養(yǎng)PEDV的細(xì)胞除了最常用的Vero細(xì)胞外，還有PK、CPK、MA104、PK-15、ESX等[13]，其中常用的是PK-15細(xì)胞。

2免疫電鏡法

免疫電子顯微鏡技術(shù)（immunoelectron microscopy，IEM）是免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，是在超微結(jié)構(gòu)水平研究和觀察抗原、抗體結(jié)合定位的一種方法。它主要分為兩大類：一類是免疫凝集電鏡技術(shù)，即采用抗原抗體凝集反應(yīng)后，再經(jīng)負(fù)染色直接在電鏡下觀察；另一類是免疫電鏡定位技術(shù)。免疫電鏡的應(yīng)用使得抗原和抗體定位的研究進(jìn)入到亞細(xì)胞的水平。由于PEDV屬于冠狀病毒，在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上與豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）在普通電鏡下不容易區(qū)分。王繼科等[14]建立了改進(jìn)的直接IEM 方法，以鑒定、區(qū)分PEDV和TGEV，該方法具有3次篩選作用。2015年，Lavazza等[15]建立了檢測(cè)PEDV等病毒的IAEM（immuno-aggregation electron microscopy）方法，該方法結(jié)合IEM法和ns-EM（negative staining electron microscopy method）法，是一種非常敏感和特異的方法。免疫電鏡法雖然具有敏感性高、特異性強(qiáng)、定性準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器的要求較高。

3免疫學(xué)檢測(cè)方法

3.1血清中和試驗(yàn)（serum neutralization test，SNT）

血清中和試驗(yàn)通過檢測(cè)免疫血清與病毒中和后病毒的感染力，來判定免疫血清對(duì)病毒的中和力，該方法的特異性和靈敏性均較高，主要用于病毒毒株的種型鑒定（該方法不僅可以定屬，而且可以定型）、測(cè)定血清抗體效價(jià)、分析病毒的抗原性。謝明星等[16]于1988年采用固定病毒-稀釋血清法，建立了檢測(cè)血清中抗體消長(zhǎng)規(guī)律的微量血清中和試驗(yàn)，結(jié)果表明該方法既可用于PED早期診斷，也可用于流行病學(xué)調(diào)查，此外還也能用于免疫水平的檢測(cè)。石明明[17]在傳統(tǒng)中和試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，建立了快速、新型的PEDV中和抗體檢測(cè)方法。試驗(yàn)使用的rPEDV-GFP病毒是通過反向遺傳技術(shù)，將GFP熒光基因插入至PEDV基因序列中，由于GFP自帶熒光，只要PEDV-GFP在細(xì)胞中復(fù)制，就能看見熒光，用TBS-380微型熒光計(jì)對(duì)其反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行分析并建立線性關(guān)系，比較血清樣品間抗體水平的高低，此方法與傳統(tǒng)中和試驗(yàn)相比更省時(shí)間（12 h即可出結(jié)果）。

3.2免疫熒光法（immunofluorescence，IF）

免疫熒光法就是利用免疫熒光顯微鏡觀察抗原與抗體特異性的結(jié)合，包括直接免疫熒光法、間接免疫熒光法。崔現(xiàn)蘭等[18]建立了檢測(cè)PEDV的直接免疫熒光法和間接免疫熒光法，其對(duì)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）人工感染仔豬的陽性檢出率為91.3%（42/46）。林志雄等[19]用適應(yīng)于Vero、Pk15等傳代細(xì)胞株生長(zhǎng)繁殖的PEDV-G1株建立直接免疫熒光法，同時(shí)與哈爾濱獸醫(yī)研究所的熒光抗體方法比較，陽性符合率達(dá)95%（19/20），陰性符合率達(dá)90%（9/10），并不與豬傳染性胃腸炎病毒、豬細(xì)小病毒、輪狀病毒和大腸桿菌等發(fā)生交叉反應(yīng)，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確性和特異性。朱維正等[20]用間接血凝法（IHA）和間接免疫熒光法（IFAT）對(duì)感染PEDV豬的血清進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)這2種方法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IHA的陽性檢出率（50.43%）低于IFAT（89.25%）。免疫熒光法是比較經(jīng)典的檢測(cè)PEDV的方法。

3.3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）

由于ELISA檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)快速、操作相對(duì)簡(jiǎn)單、可對(duì)血清進(jìn)行批量檢測(cè)、既可以檢測(cè)免疫后血清抗體也可以檢測(cè)感染抗原等優(yōu)點(diǎn)，該方法是檢測(cè)PEDV應(yīng)用最廣泛的方法之一。潘溪[11]通過將PEDV的N基因克隆到pCoid-1DNA載體中進(jìn)行原核表達(dá)，構(gòu)建了pCoid-1-N的重組質(zhì)粒，并將純化的N蛋白進(jìn)行包被，作為包被抗原構(gòu)建間接ELISA方法，對(duì)50份已知來源和背景的血清進(jìn)行了檢測(cè)，符合率達(dá)94%。同時(shí)，還制備了N蛋白的單克隆抗體作為競(jìng)爭(zhēng)性抗體，建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。鄭芳園[21]將PEDV的S蛋白用pET-28a為載體進(jìn)行原核表達(dá)，并將純化的Sc蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)PEDV抗體的間接ELISA方法。將5份陽性血清進(jìn)行1∶3 200倍稀釋后檢測(cè)結(jié)果呈陽性，證實(shí)了此方法的敏感性和重復(fù)性；利用該方法對(duì)偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型病毒（PCV2）、口蹄疫病毒（FMDV）、豬藍(lán)耳病毒（PRRSV）的陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均呈陰性，證實(shí)了此方法的特異性。張清真等[22]以體外表達(dá)的S蛋白為包被抗原，商品化單抗為捕獲抗體，對(duì)IgG進(jìn)行生物素標(biāo)記作為二抗，建立了檢測(cè)PEDV的雙夾心ELISA方法，該方法的最低檢測(cè)限量為20 ng/μL ， 且穩(wěn)定性和特異性較好。對(duì)25份臨床豬腹瀉樣品進(jìn)行PEDV

檢測(cè)，3份檢出為陽性，與RT-PCR結(jié)果的符合率為100%。王晨燕等[23]采用鼠源抗PEDV單克隆抗體為捕獲抗體，以兔源多克隆抗體為檢測(cè)抗體，建立了PEDV雙抗體夾心ELISA方法，該方法與輪狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒無交叉反應(yīng)，敏感度達(dá)30 μg/mL，與PCR檢測(cè)符合率為92.30%。

3.4膠體金免疫層析技術(shù)

膠體金顆粒可以通過靜電及其表面的物理特性與抗體、葡萄球菌蛋白A （SPA）等多種生物分子結(jié)合，形成蛋白質(zhì)膠體金復(fù)合物，即膠體金標(biāo)記物[24]。膠體金免疫層析技術(shù)因其具有操作簡(jiǎn)單、不需要昂貴的精密儀器、對(duì)檢測(cè)人員的素質(zhì)要求不高、有利于在基層推廣等優(yōu)點(diǎn)，目前已在許多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，如肉食品藥物殘留檢測(cè)[25]、糧食霉菌毒素的檢測(cè)、抗原抗體檢測(cè)、獸醫(yī)疾病診斷等。魏艷秋[26]應(yīng)用雜交瘤技術(shù)，以制備的N蛋白特異性單克隆抗體為材料，建立了檢測(cè)PEDV的膠體金免疫層析方法，并用RT-PCR的方法對(duì)13份不同地區(qū)采集的豬小腸樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這2種方法的陽性檢出率分別為38.46%（5/13）和 46.15%（6/13），陽性樣品的總符合率為83.5%。張利勃等[27]將基因工程表達(dá)的PEDV M蛋白抗原作為檢測(cè)線，自制的抗葡萄球菌蛋白A（SPA）多抗血清包被硝酸纖維素膜作為質(zhì)控線，對(duì)葡萄球菌蛋白A（SPA）進(jìn)行膠體金標(biāo)記作為指示介質(zhì)，制成了檢測(cè)PEDV感染豬血清抗體的快速檢測(cè)試紙，并與ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行比較，二者有相似的靈敏度，75份樣品中有65份陽性、7份陰性，符合率達(dá)96%。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2018年

4分子生物學(xué)檢測(cè)方法

4.1核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)是20世紀(jì)70年代在基因工程學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的[28]，在生化分析、分子藥理學(xué)、動(dòng)物疾病檢測(cè)及進(jìn)出口貿(mào)易檢測(cè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，新的核酸探針技術(shù)也得到了快速發(fā)展，目前探針的種類有DNA探針、RNA探針、寡核苷酸探針和新型光學(xué)核酸探針[29]。Kim等[30]將已知序列的核苷酸用地高辛進(jìn)行標(biāo)記，在特定條件下與人工感染仔豬PEDV的N蛋白的基因進(jìn)行堿基配對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEDV檢出率為9333%（14/15）。Jung等[31]利用基于RT-PCR建立的斑點(diǎn)雜交技術(shù)，采用地高辛標(biāo)記過的cDNA探針同時(shí)對(duì)PEDV和TGEV感染后的豬糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果相一致，且敏感性更高。

4.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是1985年由美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis發(fā)明的一種可在體外擴(kuò)增特定基因或RNA序列的技術(shù)。PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，目前已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、考古等領(lǐng)域進(jìn)行基因研究和分析。隨著對(duì)PCR技術(shù)研究的加深，在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上又衍生出多種PCR技術(shù)。這些技術(shù)包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重PCR、套式PCR、納米PCR，PCR技術(shù)已經(jīng)成為研究PEDV的基本技術(shù)手段并得到廣泛應(yīng)用。李劼[32]利用RT-PCR方法擴(kuò)增從仔豬臨床病料中分離出的一株P(guān)EDV（CHM2013），對(duì)其進(jìn)行全基因組序列測(cè)定，并通過繪制進(jìn)化樹，CHM2013屬于PEDV的G1亞群，與經(jīng)典毒株CV777、SM98、DR13屬于同一亞群，全基因組同源性為97.9%～99.9%，同時(shí)基于PEDV毒株CHM2013和分離出的強(qiáng)毒株BJ-2011-C的全程基因組設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行分段擴(kuò)增，為進(jìn)一步研究S基因突變對(duì)弱毒株在體外增殖和致病性的研究提供了技術(shù)支持。石堅(jiān)等[33]根據(jù)GenBank中當(dāng)前流行毒株S基因序列設(shè)計(jì)了2條特異擴(kuò)增引物，建立了一套能夠區(qū)分PEDV變異毒株和經(jīng)典毒株的套式RT-PCR方法。此方法不僅能檢測(cè)出PEDV，而且能快速鑒定毒株是否發(fā)生了變異，并且不會(huì)受其他非特異性產(chǎn)物的影響，靈敏度也較高。施開創(chuàng)等[34]建立了能夠區(qū)分PEDV經(jīng)典株、變異株及疫苗株的多重PCR方法，并與豬的其他病毒[如傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、輪狀病毒（RV）、豬瘟病毒（HCV）、偽狂犬病毒（PRV）]無交叉反應(yīng)。劉琪等[35]建立了一種能夠快速區(qū)分PEDV疫苗毒株與野毒株的巢式PCR方法，該方法能夠?qū)EDV與TGEV、RV、HCV、PRV等進(jìn)行鑒別。沈思思等[36]采用靶向PEDV S基因的引物和探針，建立了檢測(cè)PEDV的恒溫隔絕式PCR（iiPCR），結(jié)果表明該方法的特異性和靈敏性與實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法相當(dāng)，使用的恒溫隔絕式PCR檢測(cè)儀比傳統(tǒng)的PCR儀反應(yīng)效率高，其反應(yīng)總過程只需42 min，此外一鍵操作，無需設(shè)置反應(yīng)條件，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果易判讀，對(duì)操作人員素質(zhì)要求不高，無需電泳，減少了交叉污染和人為因素的影響。邢娜[37]通過系統(tǒng)化篩選TGEV和PEDV特異性探針并進(jìn)行優(yōu)化，分別標(biāo)記于磁性顆粒和納米金顆粒上，形成MMPs-RNA-AuNPs“三明治”復(fù)合物，將病毒核酸信號(hào)進(jìn)一步擴(kuò)大，并利用特殊引物通過PCR檢測(cè)特異性，分別建立了特異性針對(duì)TGEV和PEDV基于納米顆粒的超敏檢測(cè)方法（ultrasensitive nanoparticle DNA probebased PCR assay，UNDP-PCR），并在此基礎(chǔ)上又建立了同時(shí)檢測(cè)TGEV和PEDV的雙重UNDP-PCR檢測(cè)技術(shù)。

4.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）是在標(biāo)準(zhǔn)PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)是采用熒光探針或SYBR Green Ⅰ 熒光染料通過連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來判斷特異性產(chǎn)物的量。李亞青[38]根據(jù)GenBank中PEDV的CV777株及Attenuated DR13株ORF3基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，并以野毒株和疫苗毒的cDNA為模板，優(yōu)化了引物濃度和退火溫度，構(gòu)建了Eva Green熒光定量RT-PCR方法，并經(jīng)過多次驗(yàn)證，特異性和重復(fù)性好。此外，還可以對(duì)感染PEDV病豬的心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)和腸組織中的PEDV含量進(jìn)行了定量分析。勞秀杰等[39]根據(jù)PEDV N基因設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，利用SYBR Green I熒光染料建立了SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，對(duì)同一樣品3次重復(fù)試驗(yàn)，變異系數(shù)小于0.9%，最低檢測(cè)限為1×100copy/μL，比常規(guī)PCR敏感度高100倍（1×102copy/μL），特異性強(qiáng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系好，相關(guān)系數(shù)為1.0，擴(kuò)增效率為105.4%。劉鄧等[40]建立了多重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，并對(duì)PEDV、TGEV和RV進(jìn)行鑒別檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法具有較高的敏感性、特異性和重復(fù)性。

4.2.2納米PCR。

納米PCR是納米技術(shù)與生命科學(xué)交叉的成果。2005年中國(guó)科學(xué)院應(yīng)用物理所與上海交通大學(xué)首次報(bào)道了納米金粒子（Au nanoparticles）對(duì) PCR 反應(yīng)的優(yōu)化作用[41]。沈鶴柏等[42]將引物連接到金納米顆粒表面，研究基于納米金顆粒的PCR，將均相體系中的 PCR 技術(shù)擴(kuò)展到納米粒子表面。目前，納米PCR已經(jīng)在生命科學(xué)、動(dòng)物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。朱禹[43]根據(jù)PEDV和TGEV N基因的核苷酸序列分別設(shè)計(jì)了2對(duì)引物并擴(kuò)增N基因，以pMD18-T為載體，與N基因連接作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，設(shè)計(jì)出特異性引物，以特異性引物為模板，優(yōu)化退火溫度和引物的量，建立納米PCR方法。靈敏性試驗(yàn)表明，質(zhì)粒PEDV-N、TGEV-N的最低檢出量分別為7.6×101和8.5×101copy/μL。敏感性試驗(yàn)表明，普通PCR檢測(cè)的病毒RNA最低量為2.4×10-3和1.7×10-2 μg/mL，納米PCR結(jié)果比普通PCR敏感 10倍。通過理論計(jì)算可得到納米PCR檢測(cè)PEDV及TGEV的最低量達(dá)到100.5 TCID50/mL，以其他多種病毒 PPV、PCV-2、PRRSV、PRV、CSFV和 H1N1作為檢測(cè)對(duì)象，進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果均未擴(kuò)增出任何條帶。利用納米PCR的敏感性和特異性，用于臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查，為PEDV的早期診斷提供了新的方法。

4.3環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)最早由Notmi等[44]于2000年創(chuàng)建，是一種體外擴(kuò)增特異性基因片段的分子生物學(xué)技術(shù)，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于核酸檢測(cè)的各個(gè)領(lǐng)域，如病原體的識(shí)別、生物標(biāo)志物檢測(cè)、性別鑒定等。在常規(guī)LAMP擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，各國(guó)學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)并開發(fā)出一系列多重LAMP擴(kuò)增技術(shù)，如微型擴(kuò)增技術(shù)以及實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)技術(shù)。羅亞坤等[45]針對(duì)PEDV N基因設(shè)計(jì)了6條引物并對(duì)LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)溫度進(jìn)行了優(yōu)化，建立了檢測(cè)PEDV的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)限量為91 copy/mL，是常規(guī)PCR檢測(cè)方法敏感性的100倍，并與RT-PCR方法檢測(cè)的75份臨床樣品進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)這2種方法的檢測(cè)符合率為97.3%。田野等[46]也建立了檢測(cè)PEDV的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（RT-LAMP），是在原反應(yīng)液中加入一定量的逆轉(zhuǎn)錄酶，實(shí)現(xiàn)了RNA的一步擴(kuò)增。時(shí)建立等[47]針對(duì)PEDV S基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立了快速檢測(cè)PEDV的LAMP方法。此方法特異性好，敏感性強(qiáng)，將反轉(zhuǎn)錄后的病毒cDNA稀釋到108倍仍可檢出。

5小結(jié)

豬流行性腹瀉的早期診斷和豬群抗體水平的檢測(cè)，在生產(chǎn)上對(duì)疾病的預(yù)防與控制起著關(guān)鍵性作用，因此選擇一種可靠的、敏感性和特異性高、易于操作和檢測(cè)成本相對(duì)低的檢測(cè)方法也十分重要。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PEDV的檢測(cè)方法也有了顯著進(jìn)步，涉及免疫學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域。目前，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）這2種方法在臨床上的應(yīng)用較為普遍，尤其是PCR方法（多重PCR、套式PCR、熒光定量PCR）與ELISA方法相比靈敏性和特異性更高，但對(duì)儀器設(shè)備要求高，對(duì)操作人員素質(zhì)也有一定要求，特別是熒光定量PCR在設(shè)備和人員上要求更加嚴(yán)格，這使得該方法在基層生產(chǎn)中的推廣有一定的限制。使用任何一種方法都很難對(duì)疾病做出確切診斷，可根據(jù)現(xiàn)有情況選擇可靠性、準(zhǔn)確性高的2種或2種以上的方法進(jìn)行聯(lián)合診斷。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信未來會(huì)出現(xiàn)一種檢測(cè)迅速、操作簡(jiǎn)單、成本相對(duì)較低、可靠性和準(zhǔn)確性高的新檢測(cè)技術(shù)，從而為豬流行性腹瀉的診斷、流行病學(xué)調(diào)查和防控奠定基礎(chǔ)。

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