曹發(fā)昊 張百勝 馬家寧 王艷萍

摘要 [目的]研究黨參總皂苷納米乳處方組成，考察其體外透皮性能及抗黑素瘤細(xì)胞作用。[方法]根據(jù)藥物溶解性和偽三元相圖篩選黨參總皂苷納米乳處方，粒度分析儀測(cè)定其粒徑;以大鼠皮膚為模型，透皮擴(kuò)散儀研究黨參總皂苷納米乳體外透皮性能;以黑素瘤B16細(xì)胞為靶細(xì)胞，MTT法和形態(tài)觀察法研究黨參總皂苷納米乳對(duì)黑素瘤細(xì)胞的毒性作用。[結(jié)果]黨參總皂苷納米乳處方確定為Cremophor EL40/PEG400/橄欖油/蒸餾水（質(zhì)量比為28.66∶14.33∶8.25∶48.76），黨參總皂苷含量為44.75 mg/mL，粒徑為60.67 nm;黨參總皂苷納米乳12 h累積滲透量和穩(wěn)態(tài)滲透速率分別是黨參總皂苷水溶液的2.73、2.47倍;黨參總皂苷納米乳能促使黑素瘤細(xì)胞數(shù)量減少，出現(xiàn)空泡和細(xì)胞碎片，并且100～800 μg/mL黨參總皂苷納米乳對(duì)黑素瘤細(xì)胞增殖的抑制率大于相同濃度黨參總皂苷水溶液。[結(jié)論]確定了黨參總皂苷納米乳處方組成，它能增強(qiáng)黨參總皂苷透皮性能和抗黑素瘤作用，從而為納米乳開(kāi)發(fā)黨參總皂苷透皮制劑提供參考。

關(guān)鍵詞 黨參總皂苷;納米乳;透皮性能;黑素瘤細(xì)胞

中圖分類號(hào) S859.5+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）34-0001-04

黨參（Codonopsis pilosula）為桔梗科植物黨參等的干燥根，是我國(guó)傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)它具有延緩衰老、抗疲勞、抗缺氧、抗輻射、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效[1-2]。黨參總皂苷是黨參發(fā)揮藥理功效的重要成分，具有降血脂、神經(jīng)保護(hù)、抗突變、抗炎等作用[3-6]。黑素瘤是一種高度惡性的腫瘤，大多原發(fā)于皮膚，易經(jīng)淋巴管或血液轉(zhuǎn)移[7]。黨參總皂苷對(duì)黑素瘤作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，納米乳作為給藥載體具有許多優(yōu)點(diǎn)，已成為經(jīng)皮給藥研究的熱點(diǎn)[8-9]。皂苷本身是一類很好的天然乳化劑，在納米乳中可以作為藥物成分，且具有表面活性劑的性質(zhì)，故其在納米乳藥物載體開(kāi)發(fā)研究中有很好的應(yīng)用潛力[10]。筆者研究了黨參總皂苷納米乳體外透皮性能和抗黑素瘤細(xì)胞作用，以期為黨參總皂苷透皮制劑的研究開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑。

黨參總皂苷，自制;Cremophor EL40，德國(guó)BASF;PEG400，西安天正藥用輔料有限公司;橄欖油，江西省吉水中南天然香料油廠;辛酸癸酸甘油三酯，武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司;Tween-80、Span-80、1，2-丙二醇、甲醇，江蘇省海安石油化工廠;人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)食品藥品檢定研究院;香草醛，西安拉維亞生物科技有限公司;高氯酸，天津市鑫源化工有限公司。

1.1.2 儀器。

Zetasizer Nano ZS激光粒度分析儀，英國(guó)Malvern Instrument公司;TT-6藥物透皮擴(kuò)散儀，天津市正通科技有限公司;UV-2102型紫外分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司;128C酶標(biāo)儀，奧地利CliniBio公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱，日本三洋公司;倒置顯微鏡，上海光學(xué)儀器一廠。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞。SD大鼠，第四軍醫(yī)大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心;黑色素瘤B16細(xì)胞株，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 黨參總皂苷納米乳處方篩選。室溫下，將黨參總皂苷分別溶于表面活性劑（Cremophor EL40、Tween-80、Span-80）、助表面活性劑（PEG400、1，2-丙二醇）、油（辛酸癸酸甘油三酯、橄欖油）中，渦旋振蕩，直至不再溶解，測(cè)定藥物在各溶劑中的溶解情況。

將表面活性劑和助表面活性劑按質(zhì)量比（Km）混勻，得到混合表面活性劑（Smix）;將油相（Oil）和Smix混勻，得到混合油相;在混合油相中緩慢滴加水相，不斷攪拌，直至形成透明的體系，記下體系發(fā)生透明或渾濁變化時(shí)的各組分用量，用origin8.5繪制偽三元相圖。根據(jù)納米乳區(qū)大小，篩選合適的納米乳體系。

1.2.2 黨參總皂苷含量測(cè)定。

人參皂甙Re標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解，配制1.2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液。移取標(biāo)準(zhǔn)品母液30、60、90、120、150 μL于具塞試管中，60 ℃水浴中蒸干，經(jīng)香草醛-高氯酸-冰醋酸顯色反應(yīng)后，以試劑空白（隨行處理的甲醇）為參比溶液，分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。

移取待測(cè)樣品7 mL，用甲醇溶解定容到50 mL容量瓶中，從中移取120 μL經(jīng)香草醛-高氯酸-冰醋酸顯色反應(yīng)后，分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中黨參總皂苷的含量。

1.2.3 黨參總皂苷納米乳粒徑測(cè)定。樣品用蒸餾水稀釋后，激光粒度分析儀測(cè)定粒徑。

1.2.4 體外透皮試驗(yàn)。黨參總皂苷用蒸餾水配成質(zhì)量濃度44.70 mg/mL黨參總皂苷水溶液。在透皮擴(kuò)散儀接收池中加入生理鹽水接收液，將鼠皮固定在擴(kuò)散儀上，移取1 mL待測(cè)液加到供給池中，開(kāi)啟擴(kuò)散儀（溫度設(shè)定為37 ℃，轉(zhuǎn)速300 r/min），定時(shí)取樣，取樣后補(bǔ)加等體積接收液，分光光度計(jì)測(cè)定接受液中藥物含量，計(jì)算藥物累積滲透量Qn[12]。

1.2.5 體外抗黑素瘤細(xì)胞試驗(yàn)。試驗(yàn)分為無(wú)細(xì)胞對(duì)照組（只加不含細(xì)胞的培養(yǎng)液）、正常對(duì)照組和用藥組（空白納米乳組、黨參總皂苷水溶液組、黨參總皂苷納米乳組）。96孔板中每孔接種200 μL B16黑素瘤細(xì)胞懸液，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合到70%～80%時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，用藥組加入含藥培養(yǎng)液，正常對(duì)照組加入不含藥培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定A，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率=（1-A用藥組A正常對(duì)照組）×100%

1.2.6 數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黨參總皂苷納米乳處方篩選

2.1.1 黨參總皂苷溶解性試驗(yàn)。

室溫下，黨參總皂苷在表面活性劑中溶解性排序依次為Cremophor EL40、Tween-80、Span-80;在助表面活性劑中溶解性排序依次為PEG400、1，2-丙二醇;在油相中溶解性排序依次為橄欖油、辛酸癸酸甘油三酯，故選擇Cremophor EL40、PEG400、橄欖油用于確定黨參總皂苷納米乳組成。

2.1.2 偽三元相圖研究納米乳形成。

分別以Cremophor EL40、PEG400、橄欖油和蒸餾水為表面活性劑、助表面活性劑、油相和水相，偽三元相圖考察了Cremophor EL40/PEG400質(zhì)量比Km（2∶1、1∶1、1∶2）對(duì)納米乳形成的影響（圖1），圖中黑色部分代表納米乳區(qū)。納米乳區(qū)大小排序?yàn)椋↘m=2∶1）>（Km=1∶1）>（Km=1∶2）。

2.1.3 黨參總皂苷納米乳組成確定。

在相圖考察納米乳形成情況的基礎(chǔ)上，根據(jù)納米乳區(qū)的大小，初步篩選出Cremorphor EL40/PEG400/橄欖油/蒸餾水2個(gè)納米乳體系（Km=2∶1和Km=1∶1），測(cè)定藥物在其中的溶解情況。黨參總皂苷在Km=2∶1納米乳中的含量較高，最終確定黨參總皂苷納米乳的組成為黨參總皂苷/Cremophor EL40/PEG400/橄欖油/蒸餾水（質(zhì)量比為4.50∶28.66∶14.33∶8.25∶48.76）。

2.2 黨參總皂苷含量

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

分別以吸光度A和標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=4.533 3C+0.031 0（R = 0.999 6），在0.036～0.180 mg時(shí)線性關(guān)系好。

2.2.2 黨參總皂苷納米乳藥物含量。

選取3批次黨參總皂苷納米乳測(cè)定藥物含量，所得結(jié)果見(jiàn)表 納米乳中黨參總皂苷含量為44.75 mg/mL。

2.3 黨參總皂苷納米乳粒徑

粒徑測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3，黨參總皂苷納米乳粒徑為60.67 nm，多分散指數(shù)PDI為0.347，粒徑介于10～100 nm，達(dá)到納米乳要求。

2.4 黨參總皂苷納米乳體外透皮性能

黨參總皂苷納米乳12 h體外透皮的累積滲透曲線見(jiàn)圖4。黨參總皂苷納米乳12 h累積滲透量為426.17 μg/cm 是黨參總皂苷水溶液（155.98 μg/cm2）的2.73倍。黨參總皂苷納米乳和黨參總皂苷水溶液的累積滲透曲線分別為Qn=37.53t-40.07、Qn=15.21t-27.23，兩者的穩(wěn)態(tài)滲透速率J分別為37.53、15.21 μg/（cm2·h），可見(jiàn)黨參總皂苷納米乳的穩(wěn)態(tài)滲透速率J是黨參總皂苷水溶液的2.47倍，這表明納米乳有助于提高黨參總皂苷的透皮性能。

2.5 黨參總皂苷納米乳體外抗黑素瘤細(xì)胞作用

2.5.1 細(xì)胞形態(tài)觀察。

空白對(duì)照組處理的黑素瘤細(xì)胞形態(tài)有梭形、多角形等，細(xì)胞飽滿，數(shù)量多（圖5A）;

和空白對(duì)照組相比，空白納米乳作用48 h后黑素瘤細(xì)胞的形態(tài)變化不大，有梭形、多角形，但細(xì)胞密度有所減少（圖5B）;黨參總皂苷水溶液組的黑素瘤細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞變圓皺縮，某些細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)（圖5C）;和黨參總皂苷水溶液相比，黨參總皂苷納米乳作用48 h后，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少，大量細(xì)胞變圓，并且出現(xiàn)大空泡樣結(jié)構(gòu)，甚至細(xì)胞膜發(fā)生破裂，培養(yǎng)液可見(jiàn)細(xì)胞碎片（圖5D）。

2.5.2 黨參總皂苷納米乳對(duì)黑素瘤細(xì)胞增殖的影響。

MTT法測(cè)定黨參總皂苷納米乳對(duì)黑素瘤細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。100～800 μg/mL空白納米乳對(duì)黑素瘤細(xì)胞增殖的最大抑制作用為8.56%，按毒性分級(jí)法評(píng)價(jià)，空白納米乳對(duì)細(xì)胞的毒性為1級(jí)，達(dá)到合格要求[12]。100～800 μg/mL黨參總

皂苷納米乳對(duì)黑素瘤細(xì)胞增殖的抑制率大于相同濃度黨參總皂苷水溶液，這表明納米乳能增強(qiáng)黨參總皂苷對(duì)黑素瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。

3 討論

納米乳主要是由表面活性劑、助表面活性劑、油相和水相在合適配比下形成的透明體系，正是在這4種主要納米乳成分作用下，藥物能很好地溶解在納米乳中[13]。筆者首先考察了多種溶劑對(duì)藥物的溶解情況，從而確定了合適的表面活性劑（Cremophor EL40）、助表面活性劑（PEG400）、油相（橄欖油），用于進(jìn)一步篩選黨參總皂苷納米乳的組成。表面活性劑和助表面活性劑是納米乳的重要組成成分，主要是調(diào)節(jié)油水界面張力的，它們的配比對(duì)納米乳形成有很大影響，故用偽三元相圖研究納米乳形成情況，確定合適的表面活性劑和助表面活性劑質(zhì)量比Km，從而確定黨參總皂苷納米乳的組成[14]。皂苷本身有一定的乳化特性，有資料報(bào)道了皂苷可以作為天然表面活性劑用于制備納米相關(guān)藥物[15]。后續(xù)工作可以針對(duì)皂苷天然表面活性制備納米乳進(jìn)行研究，以降低納米乳中合成表面活性劑的用量，減輕其毒副作用。

該研究發(fā)現(xiàn)，納米乳能提高黨參總皂苷的透皮性能，可能是由于納米乳粒徑小，表面張力低，易于浸潤(rùn)角質(zhì)層，使角質(zhì)層水化膨松，改變了角質(zhì)層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，形成了透皮的孔道;納米乳作為藥物儲(chǔ)存庫(kù)，增大了皮膚兩側(cè)藥物的滲透濃度[16-19]。在研究體外抗黑素瘤細(xì)胞作用時(shí)，空白納米乳對(duì)黑素瘤細(xì)胞的毒性等級(jí)為1級(jí)，表明空白納米乳藥物載體對(duì)黑素瘤細(xì)胞的安全性達(dá)到合格要求;黨參總皂苷納米乳對(duì)黑素瘤細(xì)胞增殖的抑制作用強(qiáng)于黨參總皂苷水溶液，表明納米乳能增強(qiáng)黨參總皂苷的抗黑素瘤細(xì)胞作用，原因可能在于納米乳粒徑小，含有表面活性劑，易于和細(xì)胞膜相互作用，利于藥物吸收;富集藥物，起到藥物貯存庫(kù)的作用[20]。后續(xù)工作需要深入研究黨參總皂苷納米乳和皮膚、黑素瘤細(xì)胞的作用機(jī)制，從而更好地解釋納米乳的透皮性能和抗黑素瘤細(xì)胞作用。

4 結(jié)論

黨參總皂苷納米乳組成為Cremophor EL40/PEG400/橄欖油/蒸餾水（質(zhì)量比28.66∶14.33∶8.25∶48.76），黨參總皂苷含量為44.75 mg/mL，其粒徑為60.67 nm，多分散指數(shù)PDI為0.347;黨參總皂苷納米乳的透皮性能和抗黑素瘤細(xì)胞增殖作用強(qiáng)于黨參總皂苷水溶液，從而為利用納米乳藥物載體開(kāi)發(fā)黨參總皂苷透皮制劑提供依據(jù)。

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