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重組角質細胞生長因子(KGF)的原核表達及優(yōu)化

2018-05-14 08:59田順立鄭春陽
安徽農業(yè)科學 2018年33期

田順立 鄭春陽

摘要?[目的]在原核表達系統(tǒng)中進行重組人角質細胞生長因子(KGF)的表達及優(yōu)化。[方法]選取缺失N端23個氨基酸殘基的KGF片段作為目的基因,按照大腸桿菌的密碼子偏好性,將其進行密碼子優(yōu)化。使用BL21(DE3)菌株表達KGF(ΔN23)、SUMO融合的SUMO-KGF(ΔN23)和Fh8-SUMO融合的Fh8-SUMO-KGF(ΔN23),并測試不同表達溫度(37、23 ℃)對KGF(ΔN23)表達結果的影響。[結果]在BL21(DE3)菌株中,37 ℃表達時KGF(ΔN23),SUMO-KGF(ΔN23)和Fh8-SUMO-KGF(ΔN23)的表達量都較高,其中可溶性蛋白表達量KGF(ΔN23)< SUMO-KGF(ΔN23)< Fh8-SUMO- KGF(ΔN23)。降低誘導溫度為23 ℃后,3種KGF的表達量都顯著降低,但是可溶性蛋白的占比顯著提高,均接近100%。[結論]降低誘導溫度能夠促進KGF的可溶性表達,但是總蛋白的表達水平顯著下降;與可溶性標簽蛋白融合表達能夠提高KGF在37 ℃表達時可溶性蛋白占比,其中融合Fh8-SUMO標簽的KGF表達量和可溶性蛋白占比較高。

關鍵詞?角質細胞生長因子(KGF);原核表達系統(tǒng);密碼子優(yōu)化;融合表達;標簽蛋白

中圖分類號?Q813;Q816文獻標識碼?A文章編號?0517-6611(2018)33-0071-04

角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)又稱為成纖維細胞生長因子-7(fibroblast growth factor-7,F(xiàn)GF-7),是FGFs超家族中角質細胞生長因子家族中的一員。KGF最初是從人胚胎肺成纖維細胞系M426的培養(yǎng)上清中分離純化出來的,具有促進小鼠角質細胞有絲分裂的作用[1]。后來的研究發(fā)現(xiàn),KGF是由各種來源的間質細胞表達分泌的,其主要作用是促進各種類型上皮細胞的增殖和分化,在受損上皮細胞的修復和各種組織器官的傷口愈合過程中發(fā)揮著重要作用[1-4]。

人類KGF的cDNA編碼產生具有分泌信號肽的194個氨基酸的蛋白質。從人成纖維細胞培養(yǎng)基中分離的天然KGF,其表觀分子量為26~28 kD,而在大腸桿菌中重組表達的KGF,其表觀分子量約為21 kD,這與KGF N末端附近的N-和O-連接的糖基化修飾有關[5-7]。重組表達的KGF,雖然沒有經過翻譯后修飾,但是仍具有生物活性,且其活性遠遠高于分離所得的天然KGF[5]。另外,有試驗表明,刪除KGF信號肽序列下游的前23個氨基酸殘基,并不會改變KGF的活性,但是能夠顯著增加其穩(wěn)定性[5,8]。

雖然KGF能夠在哺乳動物細胞、植物細胞和昆蟲細胞中產生,但是這些來源的蛋白存在交叉感染的風險性,且成本高、價格昂貴,導致KGF的藥物應用受到很大的限制。相比之下,原核表達系統(tǒng)則具有一定的成本優(yōu)勢。但是,到目前為止,KGF在原核系統(tǒng)中的重組表達并未取得很好的成果,存在蛋白表達水平低、穩(wěn)定性差的問題[5,9]。為了實現(xiàn)KGF在原核系統(tǒng)中的規(guī)模化生產,筆者擬在原核表達系統(tǒng)中進行重組人源KGF的表達及優(yōu)化。

1?材料與方法

1.1?菌株與質粒

大腸桿菌克隆菌株DH5α購買自北京全式金生物技術有限公司,表達菌株BL21(DE3)購買自Promega公司,表達質粒pET11a和pET28a均購自NEB公司,質粒pET28a-SUMO由筆者所在實驗室改造構建。

1.2?KGF基因的合成

以人的角質細胞生長因子基因(GenBank:HF548201.1)作為原始序列,參照大腸桿菌的密碼子偏好對基因序列進行密碼子優(yōu)化,然后由生工生物工程(上海)有限公司進行全基因合成。

1.3?原核表達載體的構建

以合成的KGF基因為模板,通過PCR擴增缺失信號肽下游N端23個氨基酸的KGF片段,所用引物為F1(5-TTTAAGAAGGAGATATACATGTCTTACGACTACATGGAAGGTGG-3)和R1(5-GCTTTGTTAGCAGCCGTCAGGTGATCGCCATCGG-3)。PCR產物經純化后,通過重組克隆的方式連接到表達載體pET11a(經NdeI/BamHI線性化),得KGF片段的表達載體pET11a-KGF(ΔN23)。

以上述質粒為模板,通過PCR擴增KGF片段,所用引物為F2(5-GTGAACAGATCGGTGGTTCTTACGACTACATGGAAGGTGG-3)和R2(5-GAATTCGGATCCATGGTCAGGTGATCGCCATCGG-3)。PCR產物經純化后,通過重組克隆的方式連接到表達載體pET28a-SUMO(經MscI線性化),得KGF片段的表達載體pET28a-SUMO-KGF(ΔN23)。

由金唯智公司合成編碼Fh8的基因(210 bp,Genebank:AF213970),通過PCR將其擴增,所用引物為F3(5-GCCGCGCGGCAGCCATATGCCTAGTGTTCAAGAGG-3)和R3(5-AACTTCAGAGTCAGACATATGTGATGACAAAATCGAAAC-3)。PCR產物經純化后,利用同源重組的方法連接到表達載體pET28a-SUMO-KGF(ΔN23)(經NdeI線性化),得重組表達載體pET28a-Fh8-SUMO-KGF(ΔN23)。

1.4?目的蛋白的誘導表達及檢測

將上述構建好的表達載體,分別轉入表達菌株BL21(DE3)中。挑取單克隆至含有50 μg/mL卡那霉素或100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.4~0.6,加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導后,繼續(xù)37 ℃或23 ℃培養(yǎng)4 h,12 000 r/min離心2 min收集菌體。

用50 mmol/L Tris緩沖液(pH 8.0)將菌體重懸,超聲破碎后離心,分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳,經考馬斯亮藍R-250染色并脫色后檢測目的蛋白的表達情況。

2?結果與分析

2.1?角質細胞生長因子KGF基因的優(yōu)化

為了提高角質細胞生長因子KGF在原核細胞中的表達水平,按照大腸桿菌的密碼子偏好性,將其進行密碼子優(yōu)化,優(yōu)化后基因序列如圖1所示。

2.2?KGF片段的原核表達

根據報道,切除了N端23個殘基的KGF蛋白穩(wěn)定性顯著提高,且活性不受影響[5,8],所以筆者選取了缺失N端23個氨基酸殘基的KGF片段作為目的基因,進行原核重組表達。結果發(fā)現(xiàn),在BL21(DE3)菌株中,37 ℃誘導培養(yǎng)時,不含任何標簽的KGF(ΔN23)能夠表達,且表達量比較高,但是絕大部分蛋白以包涵體的形式存在,上清中的可溶性蛋白表達很少,不足10%(圖2)。降低誘導溫度為23 ℃后,KGF(ΔN23)幾乎完全在胞質中可溶性表達,但是其總的表達量極少(圖2)。

2.3?KGF片段原核表達的優(yōu)化

為了提高KGF(ΔN23)的

可溶性表達,嘗試將其與可溶性的標簽進行融合表達??紤]到標簽以及標簽切除后殘余殘基可能對KGF的活性和穩(wěn)定性造成一定影響,選擇能夠被ULP蛋白酶有效切除,且切除后無氨基酸殘基殘余的SUMO(small ubiquitinlike modifier)標簽與其融合表達。結果如圖3所示,與SUMO融合表達的KGF(ΔN23),在37 ℃誘導時,其表達水平顯著提高,且上清中的可溶性表達也有所增加,但是在沉淀中,以包涵體形式表達的KGF(ΔN23)仍然很多,占總蛋白的50%以上。降低溫度誘導時,KGF(ΔN23)幾乎完全在胞質中可溶性表達,但是其總的表達量顯著降低。

Costa等[10]的研究表明,強酸性標簽蛋白Fh8不僅分子量?。? kD),而且能夠提高目的蛋白在原核系統(tǒng)中的可溶性表達。為了進一步增加KGF(ΔN23)在上清中的可溶性表達,在SUMO標簽的N端增加了1個Fh8標簽,這樣既不影響SUMO蛋白酶對標簽的切割,又能增加融合蛋白的可溶性。結果如圖4所示,與Fh8-SUMO融合表達的KGF(ΔN23),在37 ℃誘導時,上清中的可溶性表達明顯增加,達到總蛋白的50%以上,且總蛋白的表達水平也有所提高。降低溫度誘導后,KGF(ΔN23)也幾乎完全在胞質中可溶性表達,且其總的表達量也比較可觀,根據SDS-PAGE估算,搖瓶培養(yǎng)可產目的蛋白20~30 mg/L。

3?討論

隨著研究的逐漸深入,各種細胞因子的發(fā)現(xiàn)及其調控機理的探明使人們認識到,細胞因子作為具有特定活性的調節(jié)蛋白,能夠參與調控人體的各種生理功能。近年來,細胞因子作為一種新型的生物應答調節(jié)劑在臨床應用上取得了令人矚目的成就,同時,其在醫(yī)療美容行業(yè)的應用價值也正在逐步突顯。

KGF作為纖維細胞生長因子超家族中的一員,能夠促進上皮細胞的增殖和分化,對多種疾病,如肺水腫、消化道損傷、皮膚和角膜損傷都具有一定的治愈效果[11]。2004年,由美國Amgen公司開發(fā)的一種重組截短型的KGF(palifermin),已經被美國食品和藥品管理局批準作為藥物,用于降低血液惡性腫瘤患者在干細胞移植前接受高劑量輻射和化療過程中黏膜炎的發(fā)病率,減少損傷的持續(xù)時間和嚴重程度[9]。目前,雖然KGF已經在原核系統(tǒng)中實現(xiàn)重組表達[5,9],但是由于KGF蛋白表達水平和穩(wěn)定性的限制,導致其生產水平降低,使藥物應用受到很大的限制。

由于原核表達系統(tǒng)的低成本,該研究嘗試在大腸桿菌中實現(xiàn)KGF的重組表達及優(yōu)化。為了提高目的蛋白的穩(wěn)定性,選取了缺失N端23個氨基酸的KGF片段作為目的基因,進行原核重組表達。通過密碼子優(yōu)化,可溶性標簽融合表達,降低誘導溫度等優(yōu)化條件,來提高KGF在原核細胞中的表達水平,并促進其在上清中的可溶性表達。結果發(fā)現(xiàn),降低誘導溫度(如23 ℃)能夠促進KGF的可溶性表達,但是總蛋白的表達水平顯著下降;與可溶性標簽蛋白融合表達不僅能促進KGF在上清中的表達,而且不會影響蛋白的總體表達水平,且標簽可嘗試在后期純化過程中切除。

綜上所述,在原核系統(tǒng)中進行KGF重組蛋白的優(yōu)化表

達,仍然是一個成本低廉且快速有效的途徑。該途徑的深入研究與優(yōu)化,有望提高KGF重組蛋白的生產水平,對實現(xiàn)KGF在臨床與醫(yī)療美容行業(yè)的應用具有重要意義。

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