張聰 樊麗博 楊會(huì)鮮 張繼穎 姚路路 周冰 張曉會(huì)

摘要?[目的]建立五加芪粉中總糖的含量測(cè)定方法，以控制五加芪粉的質(zhì)量。[方法]采用苯酚-硫酸比色法，檢測(cè)波長(zhǎng)為494 nm，以無(wú)水葡萄糖為對(duì)照品對(duì)五加芪粉中總糖的含量進(jìn)行測(cè)定。[結(jié)果]無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液的線性范圍為0.342～1.035 mg/mL（r=0.999 4），平均加樣回收率為98.5%，RSD=3.3%（n=6）。[結(jié)論]該研究確定的方法簡(jiǎn)單、可靠、準(zhǔn)確，可用于測(cè)定五加芪粉中總糖的含量。

關(guān)鍵詞?五加芪粉;總糖含量;苯酚-硫酸比色法

中圖分類號(hào)?R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào)?0517-6611（2018）33-0147-02

五加芪粉是洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司研制開(kāi)發(fā)的新型中藥免疫增強(qiáng)劑，已取得農(nóng)業(yè)部三類新獸藥注冊(cè)證書。本品具有補(bǔ)中益氣、扶正祛邪的功效，用于提高禽的機(jī)體免疫力，配合疫苗使用提高疫苗免疫效果。該制劑由黃芪和刺五加兩味中藥組成，研究表明黃芪多糖和刺五加多糖均具有顯著的免疫促進(jìn)作用[1-3]，為本品的主要有效成分。為有效控制五加芪粉的質(zhì)量，需研究并建立其多糖含量測(cè)定方法，但由于多糖組成復(fù)雜，需將其水解為單糖后再進(jìn)行測(cè)定，目前多采用葡萄糖作為對(duì)照品測(cè)定樣品中多糖的相對(duì)含量。筆者建立了苯酚-硫酸比色法測(cè)定五加芪粉總糖的含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?研究對(duì)象。五加芪粉，由洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司提供;D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)110833-200904，中國(guó)食品藥品檢定研究院，99.5%）。

1.1.2?主要儀器。UV-2100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司;AB265-S型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司;恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;HS3120型超聲波清洗器，上海楚定分析儀器有限公司。

1.1.3?主要試劑。苯酚、硫酸為分析純;水為純化水。

1.2?方法

1.2.1?對(duì)照品溶液的制備。取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成含無(wú)水葡萄糖0.6 mg/mL的溶液，即得。

1.2.2?供試品溶液的制備。取供試品50 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.3?苯酚-硫酸比色法。精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各2 mL，置25 mL容量瓶中，精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，置水浴中保溫15 min，取出，置冰水浴中冷卻3 min，加水稀釋至近刻度，再置冰水浴中冷卻3 min，取出，加水至刻度，搖勻;另量取水2.0 mL，同上平行操作作為空白對(duì)照，按照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在494 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按外標(biāo)法以吸光度計(jì)算供試品中多糖的含量[4-5]。

1.2.4?方法學(xué)考察。

1.2.4.1?測(cè)定波長(zhǎng)的選擇。精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各2 mL，置25 mL容量瓶中，精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，置水浴中保溫15 min，取出，置冰水浴中冷卻3 min，加水稀釋至近刻度，再置冰水浴中冷卻3 min，取出，加水至刻度，搖勻;另精密量取水2.0 mL，同上平行操作作為空白對(duì)照，按照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在波長(zhǎng)400～600 nm掃描。

1.2.4.2?線性關(guān)系考察。稱取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品5份，分別約為15.0、22.5、30.0、40.0、50.0 mg，精密稱定，分別置于50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別為0.342 3、0.437 8、0.638 8、0.833 8、1.034 8 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密量取5個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液各2 mL，分別置25 mL容量瓶中，按照“1.2.3”方法測(cè)定。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)、無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.2.4.3?精密度試驗(yàn)。取“1.2.4.2”制備的0.638 8 mg/mL無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液2 mL，置25 mL容量瓶中，按照“1.2.3”方法連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得葡萄糖吸光度，計(jì)算RSD。

1.2.4.4?重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取同一批號(hào)的供試品（批號(hào)20120201）50 mg，按照“1.2.2”方法制備供試品溶液，平行制備6份，測(cè)定吸光度，計(jì)算總糖的平均含量和RSD。

1.2.4.5?穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一份供試品溶液，分別于0、5、10、15、20、30 min測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD。

1.2.4.6?加樣回收率試驗(yàn)。稱取已知含量的供試品（批號(hào)20120201）25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，精密加入無(wú)水葡萄糖對(duì)照品15 mg，加水溶解并定容至刻度，搖勻，平行操作6份，按照“1.2.3”方法測(cè)定吸光度，計(jì)算平均回收率和RSD。

1.2.5?樣品的含量測(cè)定。取3批供試品，按照“1.2.2”方法制備供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算總糖的含量。

2?結(jié)果與分析

2.1?方法學(xué)考察

2.1.1?測(cè)定波長(zhǎng)的選擇。圖1表明，按“1.2.4.1”方法操作，對(duì)照品溶液和供試品溶液均在494 nm左右有最大吸收，故選擇494 nm作為樣品的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.2?線性關(guān)系的考察。按“1.2.4.2”方法操作，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)、無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程為Y=0.792 7X-0.028 8（r=0.999 4），表明0.342～1.035 mg/mL葡萄糖濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3?精密度試驗(yàn)。按“1.2.4.3”方法操作，連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得葡萄糖吸光度RSD為0.2%，表明該方法精密度良好。

2.1.4?重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.4.4”方法操作，測(cè)得總糖的平均含量為619 mg/g，RSD為1.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5?穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.4.5”方法操作，計(jì)算吸光度的RSD為1.7%，表明供試品溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6?加樣回收率試驗(yàn)。按“1.2.4.6”方法操作，由表1可見(jiàn)，平均回收率為98.5%，RSD為3.3%，表明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于五加芪粉中總糖的含量測(cè)定。

2.2?含量測(cè)定?由表2可知，五加芪粉中總糖的含量為613～623 mg/g，相對(duì)偏差為0.16%～0.44%。

3?結(jié)論與討論

多糖含量的測(cè)定方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等，其中苯酚-硫酸法是常用測(cè)定多糖含量的方法，可用于甲基化糖、戊糖和多聚糖等的測(cè)定，方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性較好，靈敏度高，適用范圍廣泛[6-7]。

黃芪為五加芪粉的君藥，黃芪多糖為黃芪提升免疫的主要有效成分，因此方法研究過(guò)程中參考了黃芪多糖注射液的含量測(cè)定方法[8]，但其供試品溶液制備方法繁瑣，而且測(cè)定過(guò)程中對(duì)照品和供試品溶液經(jīng)苯酚-硫酸顯色后定容至10 mL，五加芪粉使用其方法測(cè)定結(jié)果偏差較大。該研究中的方法供試品溶液制備過(guò)程簡(jiǎn)便，測(cè)試溶液最終定容至25 mL，平行樣品測(cè)定結(jié)果偏差較小。五加芪粉采用這2種方法測(cè)定結(jié)果一致。

該研究中的方法掃描對(duì)照品溶液和供試品溶液的最大

吸收波長(zhǎng)均在494 nm左右，而目前苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量時(shí)測(cè)定波長(zhǎng)一般為490 nm，這可能是因?yàn)楣┰嚻啡芤簼舛鹊牟煌瑢?dǎo)致顯色后溶液的最大吸收波長(zhǎng)不一致，五加芪粉在490和494 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定的結(jié)果一致，但494 nm波長(zhǎng)下的靈敏度更高，因此，確定測(cè)定波長(zhǎng)為494 nm。

該研究建立了五加芪粉中總糖含量的測(cè)定方法，方法學(xué)考察表明，該方法精密度、重復(fù)性良好，可準(zhǔn)確測(cè)定總糖的含量，從而有效控制五加芪粉的質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉樹(shù)民，張娜.刺五加多糖的現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息，2014，31（2）：116-119.

[2] 段雪磊，馬奎紅，包永占，等.刺五加免疫調(diào)節(jié)功能的研究進(jìn)展[J].中獸醫(yī)學(xué)雜志，2015（6）：72-75.

[3] 李欽，胡繼宏，高博，等.黃芪多糖在免疫調(diào)節(jié)方面的最新研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（2）：199-206.

[4] 陳芬芳，蘇建青，褚秀玲.刺五加多糖含量測(cè)定方法的建立[J].畜牧與飼料科學(xué)，2014，35（9）：19-20.

[5] 張洪波，任春曉.黃芪葉提取及黃芪多糖測(cè)定方法研究[J].黑龍江醫(yī)藥，2005，18（1）：6-8.

[6] 楊莉，王志華，陶健生.黃芪中黃芪多糖含量測(cè)定方法的比較[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005，36（9）：562-563.

[7] 張媛媛，張彬.苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法測(cè)定綠茶茶多糖的比較研究[J].食品科學(xué)，2016，37（4）：158-163.

[8] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典（2015年版二部）[S].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2016.