蔡苗 劉慶慧 萬曉媛 黃倢

摘要?[目的]了解wsv006蛋白結(jié)構(gòu)變異情況，并進一步為其蛋白功能研究提供參考資料。[方法]以2016和2017年在全國18個地區(qū)采集的WSSV陽性樣品為模板，采用PCR方法，用特異性引物擴增wsv006基因，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后進行測序，并對測序結(jié)果進行分析。[結(jié)果]在2016年的47 份樣本中有9個樣本，包括河北黃驊、山東日照、河北滄州和河北唐山4個地區(qū)的樣本中出現(xiàn)了wsv006目的條帶，檢出率為19%。在2017年的39 份 WSSV 陽性樣本中有16個樣本，包括福建霞美鎮(zhèn)、河北黃驊、廣東湛江、山東濱州、山東東營和上海6個地區(qū)的樣本中出現(xiàn)了wsv006的目的條帶，檢出率為41%。氨基酸序列比對結(jié)果顯示，擴增的wsv006編碼氨基酸變異包括氨基酸替換、插入、缺失和提前終止翻譯，其中插入的主要是脯氨酸（P）和蘇氨酸（T），插入位點在第151～166位，處于PT的交叉重復區(qū)域;終止翻譯是由于核苷酸第541位插入了GAGG，在轉(zhuǎn)錄過程中形成了終止密碼子。[結(jié)論]wsv006氨基酸序列存在明顯變異。

關鍵詞?WSSV;wsv006;變異

中圖分類號?S945.4文獻標識碼 A文章編號?0517-6611（2018）33-0075-05

對蝦白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是一類無包涵體的具囊膜、 一端有尾巴狀結(jié)構(gòu)、桿狀的雙鏈環(huán)狀 DNA病毒[1]，大小約為300 kb。1992年，WSSV最早在我國臺灣等地的對蝦養(yǎng)殖區(qū)暴發(fā)，而后在亞洲各國對蝦養(yǎng)殖區(qū)相繼暴發(fā)，給全世界各地的對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[2]，從而引起全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)者的廣泛關注。1995年，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）及亞太水產(chǎn)業(yè)養(yǎng)殖中心（NACA）將WSSV列為需要通告的重要水生動物疾病病原[3]。2001年，中國和荷蘭科學家分別報道了該病毒的全基因組DNA序列，啟動了WSSV后基因組研究[4]。2005年，國際病毒分類委員會第7次報告提出把WSSV歸入到線形病毒科（Nimaviridae）白斑病毒屬（Whispovirus），它是此新科中唯一的成員[5]。2009年，該病毒被農(nóng)業(yè)部《一、二、三類動物疫病病種名錄》列為水生生物一類動物疫病病毒[6]。WSSV感染的宿主范圍很廣，它不僅侵染各種野生及養(yǎng)殖對蝦，而且侵染其他水生甲殼類，如蟹類、螯蝦和龍蝦等，已成為對水生甲殼類危害最大、傳染最廣泛的病毒，特別是對對蝦種群影響最嚴重，至今已報道有40多種節(jié)肢動物可感染或攜帶WSSV[6-8]。

迄今為止，GenBank上共公布了7個WSSV基因全序列，研究最多的分別有中國大陸株（WSV-CN）[9]、中國臺灣株（WSSV-TW）[10]和泰國株（WSSV-TH）[11]。MARKS等[12]通過基因組全序列比對歸納出這3個毒株的基因組之間序列有約99%的核苷酸保持一致性，存在的主要差異是：①大片段序列插入/缺失;②易于發(fā)生基因重組的變異區(qū);③開放性閱讀框（open reading frames，ORFs）內(nèi)出現(xiàn)的重復單元變化差異（variable ?number ?tandem ?repeat，VNTR）[9，11];④轉(zhuǎn)座酶基因序列存在與否;⑤單核苷酸的缺失、插入及多態(tài)性（singlenucleotide polymorphisms，SNPs）。目前應用于WSSV流行病學研究的主要有ORF14/15和ORF23/24的缺失變化，ORF75、ORF94和ORF125的VNTR 數(shù)目以及單核苷酸多態(tài)性[13]，而對于WSSV其他基因的變異情況及其在WSSV流行病學研究中的作用尚未有深入的研究。wsv006基因全長885 bp，編碼295個氨基酸，有關其在不同地理樣本中的變異情況尚不清楚。該研究通過對2016和2017年我國18個地區(qū)WSSV病害暴發(fā)區(qū)采集的86份WSSV陽性樣本進行wsv006基因的 PCR 擴增、克隆和測序，分析wsv006蛋白結(jié)構(gòu)變異，為WSSV分子流行病學研究提供參考資料。

1?材料與方法

1.1?樣本來源?取2016和2017年1—7月在全國18個地區(qū)WSSV病害暴發(fā)區(qū)采集的患病樣本，樣本采集信息及各個樣本對應的wsv006擴增結(jié)果見表1、2。所有樣品采集后當天冷藏運輸至實驗室后冷凍保存在-20 ℃冰箱。

1.2?主要試劑和引物

海洋動物組織基因組 DNA 提取試劑盒（離心柱型） 購自擎科生物技術（青島）有限公司;Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs和DNA Marker均購自寶生物工程（大連） 有限公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自索萊寶生物科技（北京）有限公司;pMD18-T克隆載體、感受態(tài)細胞TOP10均購自青島秀佰銳生物器材有限公司;LB培養(yǎng)基、氨芐青霉素購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.3?病毒核酸提取?取約30 mg鰓組織，進行DNA提取，提取產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱備用。

1.4?樣本的套式PCR檢測?將DNA樣本按照《白斑綜合征（WSD）診斷規(guī)程GB/T 28630.2—2012》第2部分套式PCR 檢測法進行WSSV檢測，而后通過1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.5?wsv006基因的PCR擴增

將“1.3”中檢測呈WSSV 陽性的樣本進行 wsv006基因擴增。采用25 μL的體系：10× PCR 反應緩沖液（含 Mg2+） 2.5 μL、雙蒸水17.3 μL、dNTP 2 μL、正向引物（5-ATGAAGAATTCGCGGCAGAG-3）與反向引物（5- GGAAGATCTGAAGGAACTG-3）各1 μL，Ex Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，WSSV 模板1 μL。PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min;94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s，擴增35個循環(huán);72 ℃延伸7 min。

46卷33期?蔡 苗等?2016—2017年我國部分地區(qū)白斑綜合征病毒wsv006的變異分析

1.6?wsv006基因的克隆及序列分析

將“1.5”中的陽性 PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收純化后與載體 pMD18-T 連接，轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細胞中，在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h復蘇抗性，然后在添加氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上涂布，37 ℃過夜培養(yǎng)，每個平板挑取至少5個單菌落接種于添加氨芐青霉素的 LB液體培養(yǎng)基中 37 ℃ 振蕩4 h，取培養(yǎng)物為模板，按“1.5”方法進行鑒定，將PCR鑒定為陽性的菌液全部送到上海生工生物工程技術服務有限公司進行DNA雙向測序。測序結(jié)果采用DNAMAN8軟件進行序列比對分析，用ORF Finder處理測序結(jié)果，得到編碼的氨基酸序列，然后再用DNAMAN8軟件分析，以中國株wsv006氨基酸序列作為參照（AF332093），得出氨基酸水平上的變異情況。

2?結(jié)果與分析

2.1?套式 PCR 檢測結(jié)果

2016年的47份樣本中，共有33份樣本在第1輪擴增中呈現(xiàn)WSSV陽性，其余14份樣本均在第2輪擴增中呈現(xiàn)陽性。而2017年的39份樣本中共有9份樣本在第1輪擴增中呈現(xiàn)WSSV陽性，其余30份樣本均在第2輪擴增中呈現(xiàn)陽性。

2.2?wsv006基因的克隆

2016年的47份樣本中，PCR 擴增只在河北黃驊、山東日照、河北滄州和河北唐山4個地區(qū)的樣本中出現(xiàn)了wsv006目的條帶，共有9個樣本，檢出率為19%，分別是HH-6、SR-13、SR-15、HC-19、HT-34、HT-35、HT-36、HT-40、HT-41;其余38個樣本均未擴增出該基因片段。 在2017年的44 份WSSV陽性樣本中，PCR擴增只在福建霞美鎮(zhèn)、河北黃驊、廣東湛江、山東濱州、山東東營和上海6個地區(qū)的樣本中出現(xiàn)了wsv006目的條帶，共有16個樣本，檢出率為41%，分別是FX-7、FX-8、FX-9、FX-10、FX-11、FX-13、FX-14、HH-15、HH-16、HH-17、GZ-28、GZ-29、GZ-30、ZT-36、SB-37、SH-39，其余23個樣本均未擴增出該基因片段。

2.3?序列比對?在擴增出wsv006的25個樣本中，除2017年河北黃驊的3個樣本氨基酸未發(fā)生變異外，其余22個樣本的wsv006編碼氨基酸變異明顯。氨基酸的變異類型為單個氨基酸替換與缺失、多個氨基酸插入和終止翻譯（表3、4）。在不同年份和地區(qū)的樣本中插入位點、插入序列數(shù)目和排列順序存在差異，插入的主要是脯氨酸（P）和蘇氨酸（T），插入位點處于這2種氨基酸的交叉重復區(qū)域，該區(qū)域存在2個PTPTPTPP重復單元，經(jīng)過DNAMAN比對結(jié)果顯示插入位點有3個，即第1個單元之前、2個單元之間和第2個單元之后，由于插入序列為PT循環(huán)或PT循環(huán)與PP交叉，這與重復單元序列極為相似，因此不能確定具體的插入位點，僅能確定在第151～166位。除去提前終止和未變異的樣本，由于插入氨基酸導致wsv006肽鏈的長度由原來295 aa分別變?yōu)?01、303、305和307 aa，其中301 aa長度出現(xiàn)在2016年河北唐山和2017年山東濱州的樣本中，插入序列為PTPTPT（圖1）;303 aa長度出現(xiàn)在2016年河北黃驊和2017年廣東湛江的3個樣本中，插入序列為PTPTPTPT（圖2）;305 aa長度在2016年河北唐山和2017年福建霞美鎮(zhèn)、上海的樣本中出現(xiàn)，共7個樣本，插入序列為PTPTPTPTPT;福建霞美鎮(zhèn)的FX-8樣本長度為307 aa，插入序列為PTPTPTPTPTPT（圖3）。2016年山東日照和河北滄州、唐山的樣本以及2017年山東東營的樣本中都出現(xiàn)了在第184位提前終止翻譯的現(xiàn)象（圖4），這主要是由于核苷酸序列的第541位插入了GAGG，導致了移碼突變，在轉(zhuǎn)錄過程中第543～545位形成了終止密碼子UGA。除去終止翻譯的樣本，其余的16個樣本均在第172位出現(xiàn)氨基酸的替換，T→I。

3?討論

2016年的樣本中，同一地區(qū)的樣本變異情況存在差異性，如河北黃驊的樣本中，其wsv006基因編碼長度包含301、305 aa，并出現(xiàn)提前終止翻譯的現(xiàn)象。不同地區(qū)的變異情況也存在相似性，河北黃驊的HH-06和河北唐山的HT34、HT35和HT40變異情況相似，其中HT34和HT40的序列完全相同。山東日照的SR-13和SR-15，河北滄州的HC-19和河北唐山的HT-36和HT-41出現(xiàn)的變異類型一致，并且都在第184位終止翻譯，其中SR-13、HC-19、HT-36和HT-41序列完全相同。2017年的樣本中，同一地區(qū)樣本變異情況的一致性主要體現(xiàn)在河北黃驊和廣東湛江的樣本中;而福建霞美鎮(zhèn)的樣本除FX-07以外，其他6個樣本序列完全相同，在表現(xiàn)出差異性的同時又保持了一致性。山東東營SD-38出現(xiàn)3種變異類型，即替換、插入和缺失，并且它還是2017年樣本中唯一出現(xiàn)提前終止的樣本。

將這些樣本經(jīng)過motify scan軟件分析后發(fā)現(xiàn)，這些變異位點并不在其功能域內(nèi)。插入序列主要是脯氨酸（P）和蘇氨酸（T），脯氨酸能夠增強植物的抗性，有研究表明，植株染病毒的番茄花藥發(fā)育過程中游離脯氨酸積累開始較晚，任一花藥發(fā)育時期花藥中的游離脯氨酸含量均低于同一發(fā)育時期的健康植株，花粉萌發(fā)率也低[14]。植物在環(huán)境脅迫條件下，脯氨酸對植物的生理代謝有很大影響[15]。蘇氨酸的結(jié)構(gòu)中含有羥基，對人體皮膚具有持水作用，與寡糖鏈結(jié)合，對保護細胞膜起重要作用，在體內(nèi)能促進磷脂合成和脂肪酸氧化。目前，德國科學家在人體血液中發(fā)現(xiàn)了一種蘇氨酸，試驗發(fā)現(xiàn)它可以阻止艾滋病病毒附著和侵入體細胞，通過干擾艾滋病病毒的表面蛋白，使其不能發(fā)揮作用。因此，wsv006功能以及氨基酸變異對其功能的影響需要深入研究。

參考文獻

[1] WONGTEERASUPAYA C，VICKERS J E，SRIUAIRATANA S，et al.A nonoccluded，systemic baculovirus that occurs in cells of ectodermal and mesodermal origin and causes high mortality in the black tiger prawn Penaeus monodon[J].Dis Aquat Org，1995，21（1）：69-77.

[2] 蔡生力，黃倢，王崇明，等.1993─1994年對蝦暴發(fā)病的流行病學研究[J].水產(chǎn)學報，1995，29（2）：112-119.

[3] SNCHEZPAZ A.White spot syndrome virus：An overview on an emergent concern[J].Vet Res，2010，41（6）：1-34.

[4] 朱建中，陸承平.對蝦白斑綜合征病毒研究概況[J].動物醫(yī)學進展，2003，24（1）：47-49.

[5] MAYO M A.A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV[J].Arch Virol，2002，147（8）：1655-1663.

[6] 童桂香，黎小正，韋信賢，等.白斑綜合征病毒廣西株缺失區(qū)基因的比較分析[J].上海海洋大學學報，2014，23（1）：8-14.

[7] 姚泊，何建國，莫福.白斑綜合癥桿狀病毒對對蝦和羅氏沼蝦致病性的研究[J].廣州大學學報（自然科學版），2002，1（1）：35-38.

[8] WANG B，LI F H，DONG B，et al.Discovery of the genes in response to white spot syndrome virus（WSSV）infection in Fenneropenaeus chinensis through cDNA microarray[J].Marine biotechnol，2006，8（5）：491-500.

[9] YANG F，HE J，LIN X H，et al.Complete genome sequence of the shrimp white spot bacilliform virus[J].Journal of virology，2001，75（23）：11811-11820.

[10] TSAI M F，YU H T，TZENG H F，et al.Identification and characterization of a shrimp white spot syndrome virus gene that encodes a novel chimeric polypeptide of cellular type thymidine kinase and thymidylate kinase[J].Virology，2000，277（1）：100-113.

[11] VAN HULTEN M C，WITTEVELDT J，PETERS S，et al.The white spot syndrome virus DNA genome sequence[J].Virology，2001，286（1）：7-22.

[12] MARKS H，GOLDBACH R W，VLAK J M，et al.Genetic variation among isolates of white spot syndrome virus[J].Arch Virol，2004，149（4）：673-697.

[13] 童桂香，黎小正，韋信賢，等.白斑綜合征病毒廣西株缺失區(qū)基因的比較分析[J].上海海洋大學學報，2014，23（1）：8-14.

[14] 王少先，林曉民，劉保國.感染病毒的番茄花藥發(fā)育過程中游離脯氨酸含量與花粉萌發(fā)率的變化（簡報）[J].植物生理學通訊，1999，35（3）：191-192.

[15] 朱虹，祖元剛，王文杰，等.逆境脅迫條件下脯氨酸對植物生長的影響[J].東北林業(yè)大學學報，2009，37（4）：86-89.