趙秀芳

[摘 要]本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)分離自合歡樹葉片中的一株內(nèi)生細(xì)菌HHY-3的生防作用進(jìn)行了初步研究。通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)測(cè)定了該細(xì)菌對(duì)5種病原真菌的抑制作用；利用其發(fā)酵液進(jìn)行了合歡枯萎病的防治。結(jié)果顯示：該菌對(duì)蘋果樹腐爛病菌、梨黑星病菌、合歡枯萎病菌有較好的抑制作用，抑制率分別為75.2%、70.3%和68.5%，而對(duì)銀杏褐斑病菌、珍珠梅葉枯病菌的抑制率只為43.8%和35.6%。3種不同接種方法對(duì)合歡枯萎病的防治效果不同，其中同時(shí)接種防治效果最好為70.1%。

[關(guān)鍵詞]合歡樹；內(nèi)生細(xì)菌；抑制作用；防效

[中圖分類號(hào)]S641.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

銀合歡（ Albizzia julibrissin ） 又稱絨花樹等，屬豆科類植物，在我國(guó)華北地區(qū)、黃河流域及華南各地均有廣泛種植，另外在朝鮮、越南、印度、日本等亞洲地區(qū)也有分布，且合歡品種資源非常豐富。合歡不僅在綠化園林中運(yùn)用廣泛，作為行道樹美化環(huán)境；而且它在原材料和中醫(yī)藥中也有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，人們?cè)趯?duì)合歡防治病害的研究中主要是對(duì)其組織內(nèi)的有機(jī)化合物的分離、純化和鑒定。Han等對(duì)合歡汁液進(jìn)行提取和初步鑒定，發(fā)現(xiàn)它含有20余種化合物，包括甾醇、苷黃酮類化合物、有機(jī)酸、神經(jīng)酰胺及苷等多種活性物質(zhì)，在中藥藥理中具有抗過(guò)敏、抗氧化、抗癌、抗炎、殺菌、增加免疫力等多種作用。如合歡葉組織的提取物可以很好地預(yù)防黃瓜霜霉病（Pseudoperonospora cubensis）；合歡粗提物對(duì)根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp）有較強(qiáng)的抑制作用；此外還可以防治油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）；合歡莖葉含有的有效物質(zhì)對(duì)腐爛病菌（Valsa mali）、炭疽病菌（Colletotrichum capsici）均有一定程度的抑制作用效果，說(shuō)明合歡組織里存在許多抑菌活性物質(zhì)，而且抑菌譜較廣。而關(guān)于從合歡組織中分離內(nèi)生菌進(jìn)行病害防治的研究鮮為報(bào)道。

目前已經(jīng)證實(shí)內(nèi)生細(xì)菌廣泛存在于健康植物體內(nèi)，可以提高植物抗逆能力，改善系統(tǒng)生態(tài)平衡；具有多種特性，使之成為植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分；同時(shí)內(nèi)生細(xì)菌還是良好的外源基因載體，為抗病、殺蟲和固氮等外源基因?qū)胫参矬w內(nèi)提供了新的途徑和方法。當(dāng)前植物內(nèi)生菌的研究在深度及廣度上都有很大進(jìn)展，對(duì)于植物內(nèi)生菌植物資源的研究更是寬泛，從作物、果蔬到中草藥、野生植物等。說(shuō)明我國(guó)植物資源分布廣泛，植物內(nèi)生菌資源種類豐富。本試驗(yàn)根據(jù)合歡的藥用性及較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和抗病能力，以內(nèi)生細(xì)菌的研究技術(shù)為基礎(chǔ)，對(duì)合歡的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行生防研究，以期為園林及藥用植物內(nèi)生細(xì)菌開(kāi)發(fā)利用、生防機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

合歡樹內(nèi)生細(xì)菌HHY-3，分離于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園里的合歡樹葉片，4℃保存，菌體存放在50%的甘油中可于-20℃長(zhǎng)期保存。

蘋果腐爛病菌（Valsa mali ）、梨黑星病菌（Venturia piritna）、合歡枯萎病菌（Fusarium oxysporwm schl.f.sp.perndiosium）、珍珠梅褐斑病菌（ Sorbaria sorbifolia）、銀杏葉枯病菌（Alternaria alternata）以上菌株均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)化保實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試合歡種子

合歡為品種銀合歡（Leucaena leucocephala）（星河雙葉種業(yè)）。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基的制作參照方中達(dá)所述方法。

1.2 使用方法及步驟

1.2.1 菌種活化及發(fā)酵液的制備

將HHY-3菌種從4℃冰箱取出，用滅菌的挑針挑取單菌落，在新的LB培養(yǎng)基上劃線，放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3 d即可。

將合歡枯萎病菌等5種病原菌用直徑為4mm打孔器，打成菌餅，將菌餅接入到新的PDA培養(yǎng)基中，5 d待用。

將活化后HHY-3菌株，用打孔器在細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛的地方打孔，用接種針挑取良好的菌餅，放置于NA培養(yǎng)基里，每6塊菌餅放置在一個(gè)三角瓶（含50 mL液體NA）中，放在30℃搖床中，在160 r/s條件下，發(fā)酵培養(yǎng)7 d。通過(guò)三層紗布過(guò)濾發(fā)醇液，去掉菌絲，過(guò)濾后的液體用小孔徑纖維素膜抽濾，得到細(xì)菌的無(wú)菌發(fā)酵液。

1.2.2 合歡種植

將合歡種子在0.3%甲醛溶液中浸泡15 min，用清水洗凈，用80℃熱水浸泡30 min。種植含有基質(zhì)的育苗缽中（每個(gè)小缽邊長(zhǎng)為5 cm），放到室溫下（20-30℃）生長(zhǎng)，根據(jù)生長(zhǎng)情況補(bǔ)充水分。

1.2.3 細(xì)菌的對(duì)峙抑制試驗(yàn)

菌株采用平板對(duì)峙法篩選，對(duì)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行抑菌測(cè)定，計(jì)算抑制率。以不接細(xì)菌為對(duì)照，3次重復(fù)。抑制率（%）=（1-處理菌落直徑/對(duì)照菌落直徑）×100。

1.2.4 接種與防治

進(jìn)行灌根接種，使菌液均勻展布在葉片正反面，罩上塑料棚布，保濕24 -36 h。7-14 d后合歡陸續(xù)發(fā)病，開(kāi)始調(diào)查病情，然后噴施相關(guān)藥劑進(jìn)行防治，以噴施無(wú)菌水為對(duì)照。分別于14和21 d時(shí)

2 結(jié)論與討論

生物農(nóng)藥不僅具有提高作物抗逆性，而且在維持生態(tài)平衡方面也有很大的作用。隨著國(guó)家落實(shí)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的進(jìn)程，加上人們對(duì)環(huán)境和生態(tài)保護(hù)的密切關(guān)注，生物農(nóng)藥的研究開(kāi)發(fā)越來(lái)越受到全社會(huì)的重視。我國(guó)政府也越來(lái)越重視可持續(xù)性發(fā)展，環(huán)境保護(hù)生態(tài)平衡，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)安全的農(nóng)副產(chǎn)品是必然趨勢(shì)。微生物農(nóng)藥具有種類多，易控制，能規(guī)?；a(chǎn)等特點(diǎn)，且占生物農(nóng)藥的絕大部分，是生物控制的重要方法。政府對(duì)微生物農(nóng)藥的研發(fā)政策支持和經(jīng)費(fèi)投入都不斷加大，使科研人才尖端化設(shè)備先進(jìn)化，科研人員對(duì)微生物農(nóng)藥的研究逐漸深入。本試驗(yàn)中，在合歡葉片中分離提取出的內(nèi)生細(xì)菌HHY-3能夠抑制多種植物病原真菌。通過(guò)盆栽試驗(yàn)表明，內(nèi)生細(xì)菌HHY-3發(fā)酵液在一定水平上能夠防治合歡枯萎病害。雖然通過(guò)盆栽試驗(yàn)證明菌株HHY-3發(fā)酵液可以很好地防治合歡枯萎病害，但需要2-3年甚至更多的時(shí)間對(duì)其進(jìn)行田間試驗(yàn)來(lái)對(duì)其防治效果和作用機(jī)制做進(jìn)一步的研究，除此之外，關(guān)于該菌株在合歡植株中的寄生能力也需要更進(jìn)一步研究，以便為該菌株在未來(lái)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供更為可靠的理論依據(jù)。

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