高崇 吳國賀 李佰霖 安承榮 高歌農(nóng) 盧寶慧 高玉亮 田慧敏 鄭成叡 崔昌范

摘 要：為防控延邊煙區(qū)煙草菌核病提供基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)，開展了病原菌鑒定及抗性種質(zhì)材料篩選研究。將收集的病原菌核采用常規(guī)方法進(jìn)行分離、純化，經(jīng)致病性測定、形態(tài)學(xué)特征觀察、rDNA-ITS測序比對及基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定病原菌種類；并采用離體葉片法、活體葉片法對61份種質(zhì)材料進(jìn)行抗性篩選。結(jié)果表明：（1）經(jīng)形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)方法鑒定該病原菌為核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary]。（2）兩種方法篩選出31份高感材料、6份中感材料、15份抗病材料，鑒定結(jié)果一致率為85.25%，未篩選到免疫和高抗種質(zhì)材料。延邊煙區(qū)煙草菌核病病原菌為核盤菌，離體葉片法、活體葉片法可用于苗期煙草種質(zhì)材料對菌核病抗性篩選。

關(guān)鍵詞：煙草菌核??；離體葉片法；活體葉片法；抗性種質(zhì)

中圖分類號：S435.72 文章編號：1007-5119（2018）02-0069-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.02.010

Identification of Tobacco Sclerotinia Rot in Yanbian and Screening for Resistant Germplasms

GAO Chong1， WU Guohe1， LI Bailin1， AN Chengrong1， GAO Genong2， LU Baohui3，

GAO Yuliang1， TIAN Huimin4， ZHENG Chengrui5， CUI Changfan1*

（1. Yanbian Academy of Agricultural Sciences， Longjing Jilin 133400， China； 2. Jilin Tobacco Monopoly Administration （Company）， Changchun 130000， China； 3. College of Agricultural， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China； 4. College of life sciences， Chifeng university， Chifeng， Inner Mongolia 024000， China； 5. Yanbian Branch of Jilin Tobacco Corporation Company， Yanji， Jilin 133000， China）

Abstract： Identification of pathogen and screening for resistant germplasm materials were conducted for providing fundamental data and theory for controlling tobacco sclerotinia rot in Yanbian tobacco areas. The sclerotium of pathogen were collected in 2015， and then isolated and purified by conventional methods. Pathogen was identified through pathogenicity test， morphological characteristics， sequence analysis of the internal transcribed spacer region of the ribosomal DNA （rDNA-ITS） and phylogenetic analysis based on rDNA-ITS sequences. 61germplasm materials were screened by in vitro leaf-assay method and living leaf-assay method. The results showed that： （1） The pathogen was identified as [Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary] by morphology and molecular biology methods. （2） 31 high sensitive germplasms， 6 medium sensitive germplasms and 15 resistance ones were identified by the two methods with a consistent rate of 85.25%. No immune or high resistant germplasms，was identified. The pathogen of tobacco sclerotinia rot was [Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary] in Yanbian tobacco areas. In vitro leaf-assay and living leaf-assay methods can be used to screen the resistance of germplasm materials to sclerotinia rot at seedling stages of tobacco.

Keywords： tobacco sclerotinia rot； vitro leaf-assay method； living leaf-assay method； resistant germplasm

吉林省延邊州植煙歷史悠久，生產(chǎn)的煙葉品質(zhì)在國內(nèi)獨(dú)樹一幟，深受全國卷煙企業(yè)喜愛。煙草有害生物是影響延邊煙區(qū)優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的因素之一，經(jīng)2010—2014年有害生物調(diào)查發(fā)現(xiàn)，煙草菌核?。═obacco sclerotinia rot）在吉林省延邊煙區(qū)有逐年加重危害趨勢，煙株莖部（葉片）感染病原菌后，

基金項目：吉林省煙草專賣局（公司）項目“吉林省煙草有害生物調(diào)查研究”{[2010]83號}

作者簡介：高 崇（1981-），男，副研究員，主要從事煙草有害生物綜合治理研究。E-mail：gchong1981@126.com

*通信作者，E-mail：1656242643@qq.com

收稿日期：2017-10-10 修回日期：2018-01-10

葉片變黃凋萎，失去應(yīng)用價值[1-2]。據(jù)報道，美國、日本等國家已發(fā)現(xiàn)煙草菌核?。辉摬『υ趶V東、廣西、貴州、四川、湖北、浙江、安徽、黑龍江等省（自治區(qū)）煙區(qū)亦有發(fā)生[3]。明確病原菌種類是開展科學(xué)防控的基礎(chǔ)。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）在病原菌種類鑒定中被廣泛應(yīng)用，較單一傳統(tǒng)生物學(xué)鑒定更加準(zhǔn)確、便捷。王靜等[4]通過病原菌形態(tài)學(xué)特征及18S rDNA序列分析，明確山東煙草白絹病病原菌為齊整小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc.）；楊濤等[5]通過形態(tài)學(xué)觀察、rDNA-ITS和Plasma membrane ATPase（ATPase）基因進(jìn)行測序分析，進(jìn)一步證實(shí)湖北煙區(qū)煙草赤星病為鏈格孢（Alternaria alternata）、長柄鏈格孢（A. longipes）、細(xì)極鏈格孢（A. tenuissima）和鴨梨鏈格孢（A. yaliinficiens）侵染所致。防治植物病害最有效的方法是種植抗病品種，而抗性種質(zhì)是抗病育種的基礎(chǔ)，董利東等[6]從全國11個省份286份野生大豆資源中篩選出34份菌核病抗性種質(zhì)材料；申宏波等[7]對黑龍江省346份種質(zhì)資源進(jìn)行大豆菌核病耐病性鑒定，從中鑒定出2級耐病種質(zhì)3份、1級耐病種質(zhì)3份。然而，有關(guān)煙草菌核病上述研究未見報道。本文對吉林省延邊煙區(qū)煙草菌核病病原菌采用形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)方法進(jìn)行種類鑒定，并開展抗性資源篩選研究，為病害的科學(xué)防控及抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌鑒定

1.1.1 供試病原菌收集、分離與純化 供試病原菌核于2015年10月采自吉林省延邊煙田內(nèi)患菌核病煙株莖稈，帶回實(shí)驗(yàn)室，采用組織分離法[8]進(jìn)行分離、純化，獲得純培養(yǎng)菌株。

1.1.2 致病性測定 在溫室內(nèi)，采用傷口菌碟貼莖接種保濕法[9]。接種時間為2015年11月8日，接種7 d后，觀察記載莖部接種處癥狀，對照莖部接種PDA培養(yǎng)基。顯癥后再次分離鑒定該病原菌，完成柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.1.3 病原菌形態(tài)觀察 將菌株重新接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，逐日觀察培養(yǎng)基上菌落特征及菌核形態(tài)、色澤變化，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)[3，10]。

1.1.4 病原菌rDNA-ITS序列測定 采用改良CTAB法[11]提取基因組DNA。采用真菌核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）通用引物ITS4（5?-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3?）和ITS5（5?- GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3?）擴(kuò)增病原菌rDNA-ITS序列，引物由上海生工生物公司合成。25 μL PCR反應(yīng)體系為：2×PCR Mix 12.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、DNA模板1 μL，以無菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μL；擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s；55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共32個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

將擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收DNA片段，進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對；并采用MEGA5.0軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2 抗性種質(zhì)材料篩選

1.2.1 供試種質(zhì)材料 供試種質(zhì)材料由延邊農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所收集并保存，具體明細(xì)見表1。于2016年冬季在溫室內(nèi)盆栽各供試種質(zhì)材料30株，栽植土壤草炭∶蛭石體積比為2∶1，煙苗進(jìn)行常規(guī)管理。

1.2.2 抗性鑒定方法 待盆栽煙苗第1片真葉長10 cm時，采用離體葉片法、活體葉片法[12-16]進(jìn)行接種，20～25 ℃保濕培養(yǎng)，3 d后調(diào)查接種葉片病斑大小。同一方法每份種質(zhì)接種5株，設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3 分級方法 依據(jù)接種3 d后葉片病斑大小進(jìn)行病害分級[12]：0級，無癥狀或癥狀不明顯；1級，形成直徑1～4 mm水漬狀黃褐色病斑；2級，形成直徑5～9 mm水漬狀黃褐色病斑；3級，形成直徑10～14 mm水漬狀黃褐色病斑；4級，形成直徑15～19 mm水漬狀黃褐色病斑；5級，形成直徑>20 mm水漬狀黃褐色病斑。

1.2.4 抗性標(biāo)準(zhǔn) 采用相對抗病程度方法劃分種質(zhì)材料對菌核病抗性能力[17]，用相對抗病指數(shù)（Relative resistant index，RRI）來表示，免疫（I）：RRI=1.0；高抗（HR）：0.80≤RRI<0.99；抗?。≧）：0.40≤RRI<0.79；中感（MS）：0.20≤RRI<0.39；高感（HS）：RRI<0.20。

1.2.5 病情指數(shù)計算公式 病情指數(shù)=[∑（各級病斑數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總病斑數(shù)×最高病級代表值）]×100

相對抗病指數(shù)（RRI）=1-（鑒定品種平均病情指數(shù)/發(fā)病最嚴(yán)重品種平均病情指數(shù)）

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 利用DPS軟件處理分析數(shù)據(jù)，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 病原菌鑒定

2.1.1 致病性測定 致病性測定結(jié)果表明，分離自吉林省延邊煙田內(nèi)的菌株能夠致病煙草。接種7 d后，即可見煙株莖部有大量的白色菌絲和白（黑）色菌核產(chǎn)生（圖1）；接種10 d后，煙苗心葉變褐死亡，并有白色菌絲產(chǎn)生（圖2）。

2.1.2 病原菌形態(tài)觀察 菌落呈圓形，菌絲白色，棉絮狀，不產(chǎn)生色素；7～10 d后，在培養(yǎng)基邊緣形成不定形菌核，菌核表生，先期白色，后漸變?yōu)楹谏?，表面粗糙，直?～10 mm（圖3）。顯微鏡下觀察菌絲無色、透明、有隔膜，呈多分枝狀且在菌絲的短側(cè)枝頂端產(chǎn)生小型分生孢子（圖4）。

2.1.3 病原菌rDNA-ITS序列測定 將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，其與已登記Sclerotinia sclerotiorum真菌rDNA-ITS序列相似，同源性達(dá)99%。使用MEGA 5.0軟件，選擇灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）作為外類群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果該病原菌與已鑒定為S. sclerotiorum真菌（登記號為MG249968）聚類在一起（圖5）。

經(jīng)形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)方法鑒定該病原菌為核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）deBary]，引起煙草菌核病。

圖1 煙株莖部接種病原菌（左圖）與對照（右圖）

Fig. 1 The stems inoculated with pathogen （left） and CK （right） 圖2 病原菌回接煙株葉片

Fig. 2 The leaves inoculated with pathogen

圖3 PDA培養(yǎng)基上病原菌培養(yǎng)性狀

Fig. 3 Cultural characteristics of the pathogen on PDA 圖4 病原菌菌絲顯微形態(tài)

Fig. 4 Micro-morphology of pathogen hypha

圖5 病原菌與基因庫（GenBank）中同源性較高菌株的rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig. 5 Phylogenetic tree of rDNA-ITS sequence of high homology strains from the pathogen and GenBank

2.2 抗性種質(zhì)材料篩選

由表1可知，離體葉片法接種的種質(zhì)材料病情指數(shù)高于活體葉片法。兩種方法將61份種質(zhì)材料劃分為高感（HS）、中感（MS）、抗?。≧）3個類群，有52份鑒定結(jié)果一致，占測試種質(zhì)材料的85.25%，其中包括Friedrichstaier、Geudetthelmex、CF222、CF223等31份高感材料，平均病情指數(shù)80.67～100；溫德爾、優(yōu)選1號、湄潭烤煙、三道1號等6份中感材料，平均病情指數(shù)62.67～74.67；黑

苗2645、永定1號、K730、廣東56號等15份抗病材料，平均病情指數(shù)32.67～60.00，感/抗材料比接近3：1。9份鑒定結(jié)果不一致，均相差1個抗性等級，其中HS-MS包含7個、MS-R包含2個。Friedrichstaier品種（系）在測試中表現(xiàn)出的抗性水平最低，平均病情指數(shù)為96.34；九樓煙品種（系）表現(xiàn)的抗性水平最高，平均病情指數(shù)為33.00。在本次測試中未篩選到免疫和高抗種質(zhì)材料。

表1 煙草種質(zhì)材料對菌核病抗性情況

Table 1 Resistance of germplasm resources to tobacco sclerotinia rot

編號

No. 品種（系）名稱

Variety（strain）name 離體葉片法

In vitro leaf-assay method

平均病情指數(shù) 抗性級別

Average disease index Resistance degree 1 活體葉片法

Living leaf-assay method

平均病情指數(shù) 抗性級別

Average disease index Resistance degree

32 S01-006 100 a A HS 76.00 hij GHIJK MS

33 Friedrichstaier 100 a A HS 92.67 abcd ABCD HS

34 Geudetthelmex 100 a A HS 82.67 defgh CDEFGH HS

37 CF222 100 a A HS 89.33 abcde ABCDEF HS

38 CF223 100 a A HS 92.00 abcd ABCD HS

28 NC567 99.34 a AB HS 78.67 fghi EFGHI MS

35 HavanaIIc 99.34 a AB HS 94.67 abc ABC HS

29 V2 99.34 a AB HS 84.00 defgh CDEFGH HS

41 LJ237 98.67 ab AB HS 94.67 abc ABC HS

25 小立耳 98.67 ab AB HS 88.67 bcde ABCDEFG HS

48 LJ981 98.00 abc AB HS 88.67 bcde ABCDEFG HS

43 鐵桿青 96.67 abcd ABC HS 90.00 abcd ABCDEF HS

30 大甲川煙 96.67abcd ABC HS 94.67 abc ABC HS

47 NC89 96.67 abcd ABC HS 94.67 abc ABC HS

46 三道2號 96.67 abcd ABC HS 76.00 hij GHIJK MS

55 大平板 94.67 abcde ABCD HS 89.33 abcd ABCDEF HS

58 G28-46 94.00 abcde ABCD HS 88.67 bcde ABCDEFG HS

57 H7OE-2 93.34 abcdef ABCD HS 83.33 defgh CDEFGH HS

36 CF219 92.86 abcdefg ABCD HS 97.67 ab AB HS

54 大毛柳 92.00 abcdefg ABCD HS 86.00 cdefg ABCDEFG HS

56 RGOB-18 92.00 abcdefg ABCD HS 80.00 efghi DEFGH MS

40 CF225 90.67 abcdefgh ABCD HS 84.00 defgh CDEFGH HS

42 LY0414 90.67 abcdefgh ABCD HS 90.00 abcd ABCDEF HS

表1 （續(xù)）

Table 1 （Continued）

編號

No. 品種（系）名稱

Variety（strain）name 離體葉片法

In vitro leaf-assay method

平均病情指數(shù) 抗性級別

Average disease index Resistance degree 活體葉片法

Living leaf-assay method

平均病情指數(shù) 抗性級別

Average disease index Resistance degree

50 吉煙五號 90.00 abcdefgh ABCD HS 85.33 cdefgh BCDEFGH HS

31 印尼02號 89.34 abcdefgh ABCDE HS 86.67 cdefg ABCDEFG HS

24 歪把子 88.00 bcdefgh ABCDEF HS 73.33 ijk HIJKL MS

27 G80B 88.00 bcdefgh ABCDEF HS 98.67 a A HS

39 CF224 87.34 cdefgh ABCDEF HS 77.33 ghi FGHIJ MS

45 大沙河煙 87.34 cdefgh ABCDEF HS 90.67 abcd ABCDE HS

44 小沙河煙 86.67 defghi ABCDEFG HS 91.33 abcd ABCDE HS

53 LJ911 86.00 defghi ABCDEFG HS 88.00 bcdef ABCDEFG HS

52 中煙98 86.00 defghi ABCDEFG HS 84.67 defgh CDEFGH HS

26 革新3號 85.33 efghi BCDEFG HS 86.00 cdefg ABCDEFG HS

49 吉煙七號 82.67 fghij CDEFGH HS 92.00 abcd ABCD HS

51 潘圓黃 82.67 fghij CDEFGH HS 84.00 defgh CDEFGH HS

61 吉煙九號 82.00 ghij DEFGH HS 84.33 defgh CDEFGH HS

59 小葉黃 80.67 hijk DEFGH HS 84.67 defgh CDEFGH HS

60 小黃煙 76.00 ijkl EFGHI MS 94.67 abc ABC HS

22 溫德爾 74.67 jklm FGHI MS 67.33 jkl IJKLM MS

14 優(yōu)選1號 73.34 jklm GHI MS 68.00 jkl IJKLM MS

20 Vesta64 72.67 jklm GHI MS 53.33 mn NOPQ R

19 湄潭烤煙 72.67 jklm GHI MS 64.00 l KLMN MS

17 三道1號 71.34 klm HI MS 62.67 l LMNO MS

13 土耳其雪茄 66.00 lmn IJ MS 66.67 kl JKLM MS

21 金星6007 65.34 mno IJ MS 65.34 kl JKLM MS

16 樺甸柳葉尖 58.00 nop JK R 64.25 l KLMN MS

15 二青桿 57.33 nop JKL R 52.00 mn OPQ R

23 云87 56.67 nopq JKL R 52.00 mn OPQ R

18 黑苗2645 55.34 opq JKLM R 60.00 lm MNOP R

11 永定1號 55.34 opq JKLM R 59.33 lm MNOP R

12 K730 52.00 pqr KLMN R 59.33 lm MNOP R

4 無名雪茄 50.00 pqrs KLMNO R 42.67 op QRS R

9 廣東56號 46.67 qrst KLMNOP R 48.25 no PQR R

3 中煙90 46.67 qrst KLMNOP R 45.33 nop QR R

7 Y8190 46.67 qrst KLMNOP R 36.67 pq RS R

6 Y101 44.00 rst LMNOPQ R 41.33 opq QRS R

5 Y106 42.67 rstu MNOPQ R 42.00 opq QRS R

1 春雷1號 40.67 stuv NOPQ R 46.00 no QR R

10 Xanthi-nc 37.45 tuv OPQ R 33.33 qr ST R

8 凈葉黃 34.00 uv PQ R 44.67 nop QRS R

2 九樓煙 32.67 v Q R 33.33 qr ST R

注：小寫字母不同表示差異顯著（P<0.05），大寫字母不同表示差異極顯著（P<0.01）。

Note： Lower case letters indicate significant difference at 0.05 level（P<0.05）， upper case letters indicate significant difference at 0.01 level（P<0.01）.

.

3 討 論

煙草菌核病在我國煙葉生產(chǎn)中一直被認(rèn)為是次要病害，尚未造成較大危害。經(jīng)2010—2014年煙草有害生物調(diào)查發(fā)現(xiàn)，煙草菌核病在吉林省延邊煙區(qū)危害呈上升趨勢，初步分析可能與品種抗性有關(guān)。后經(jīng)接種測試表明，延邊煙區(qū)主栽品種吉煙九號苗期對菌核病表現(xiàn)為高感。本研究于2015年首次對分離自吉林省延邊煙田內(nèi)的煙草菌核病病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)、rDNA-ITS序列比對及基于rDNA-ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確該病原菌為核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary]。據(jù) 報道，核盤菌除引起煙草菌核病外，還可引發(fā)大白菜、向日葵、大豆等多種作物菌核病[2]，吉林省延邊州大田作物以玉米、大豆、十字花科蔬菜為主，表明在田間自然條件下存在著大量菌核病侵染源，煙草輪作種植時考慮前茬作物種類，在一定程度上可預(yù)防煙草菌核病的發(fā)生。

種植抗病品種是防治病害最經(jīng)濟(jì)、有效的方法，抗性種質(zhì)材料是選育抗病品種的基礎(chǔ)。近年來，煙草抗病資源篩選工作已經(jīng)在煙草病毒病[18-19]、煙草青枯病[20-21]、煙草黑脛病[22-23]方面取得了顯著進(jìn)展，煙草菌核病抗性鑒定方法及抗病資源篩選國內(nèi)尚未見報道。一般情況下，煙草菌核病菌主要為害煙株莖部、葉片及蒴果，莖部、蒴果人工接種較葉片操作繁瑣，耗時多、顯癥時間長；離體葉片法、活體葉片法已在黃瓜[12]、向日葵[13]、花椰菜[14]、馬鈴薯[15]、水稻[16]等多種作物抗病資源篩選（鑒定）上成功應(yīng)用。本研究同時采用離體葉片法、活體葉片法進(jìn)行菌核病抗性研究，能更準(zhǔn)備、更客觀的鑒別煙草種質(zhì)材料對菌核病的抗性。試驗(yàn)中篩選出15份抗性種質(zhì)材料，占全部供試材料的24.59%，說明抗性種質(zhì)在現(xiàn)有煙草種質(zhì)材料中占一定比例，為后續(xù)抗病育種及抗病有關(guān)遺傳信息研究提供理論依據(jù)。在統(tǒng)計種質(zhì)材料抗（感）情況時發(fā)現(xiàn)，離體葉片法接種的種質(zhì)材料病情指數(shù)高于活體葉片法，且有9份鑒定結(jié)果不一致，均相差1個抗性等級，分析可能是葉片離體后，其生理代謝活動降低引發(fā)抗性下降所致。

苗期抗性鑒定與成株期田間抗性鑒定相比，具有省工省時，環(huán)境溫、濕度條件易控制等優(yōu)點(diǎn)，可將其作為種質(zhì)材料抗性鑒定的初步研究。然而，種質(zhì)材料抗性的最終評價，需結(jié)合成株期田間抗性鑒定結(jié)果。

參考文獻(xiàn)

[1] 崔昌范，單佳杰，張貴峰，等. 吉林省煙草有害生物圖鑒[M]. 長春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，2016.

CUI C F， SHAN J J， ZHANG G F， et al. Illustrations of Tobacco Pest in JiLin[M]. Changchun： Jilin Science and Technology Press， 2016.

[2] 高崇，高玉亮，吳國賀，等. 吉林省煙草有害生物種類及分布情況調(diào)查[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016（11）：77-81.

GAO C， GAO Y L， WU G H， et al. Investigation of Species and Distribution of Tobacco Pest in Jilin[J]. Heilongjiang Agricultural Sciences， 2016（11）： 77-81.

[3] 朱賢朝，王彥亭，王智發(fā)，等. 中國煙草病害[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

ZHU X C， WANG Y T， WANG Z F， et al. Tobacco Diseases of China[M]. Beijing： China Agriculture Press， 2002.

[4] 王靜，趙杰，錢玉梅，等. 山東煙草白絹病病原鑒定及室內(nèi)防治藥劑篩選[J]. 中國煙草科學(xué)，2013，34（4）：55-59.

WANG J， ZHAO J， QIAN Y M， et al. Identification and pharmaceutical screening on plate of Sclerotium rolfsii sacc. causing southern blight on tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2013， 34（4）： 55-59.

[5] 楊濤，黎妍妍，鄭露，等. 湖北煙區(qū)烤煙赤星病病原鑒定[J]. 中國煙草科學(xué)，2017，38（5）：32-38.

YANG T， LI Y Y， ZHENG L， et al. Identification of pathogens causing flue-cured tobacco brown spot in Hubei Province[J]. Chinese Tobacco Science， 2017， 38（5）： 32-38.

[6] 董利東，王金生，吳俊江，等. 野生大豆種質(zhì)資源對大豆菌核病抗性評價[J]. 大豆科學(xué)，2014，33（6）：900-902.

DONG L D， WANG J S， WU J J， et al. Identification the resistance of wild soybean germplasm to Sclerotinia sclerotiorum[J]. Soybean Science， 2014， 33（6）： 900-902.

[7] 申宏波，丁俊杰，孫文鵬，等. 黑龍江省大豆種質(zhì)對菌核病的耐病資源篩選[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，43（4）：136-140.

SHEN H B， DING J J， SUN W P， et al. Screening of soybean germplasm of tolerance to Sclerotina sclerotiorum in Heilongjiang Province[J]. Journal of Northeast Agricultural University， 2012， 43（4）： 136-140.

[8] 方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

FANG Z D. Research methods of plant diseases[M]. Beijing： China Agriculture Press， 1998.

[9] 晏立英，宋萬朵，張芳，等. 花生白絹病溫室接種技術(shù)的建立和苗期抗病性鑒定[J]. 中國油料作物學(xué)報，2017，39（5）：687-692.

YAN L Y， SONG W D， ZHANG F， et al. Artificial inoculation technique for peanut stem rot caused by Sclerotium rolfsii and evaluation resistance of peanut seedling in greenhouse[J]. Chinese Journal of Oil Crop Sciences， 2017， 39（5）： 687-692.

[10] 魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

WEI J C. Fungal identification manual[M]. Shanghai： Shanghai Science and Technology Press， 1979.

[11] 周宗山，徐成楠，吳玉星，等. 歐李炭疽病病原菌鑒定[J]. 植物病理學(xué)報，2011，41（5）：538-541.

ZHOU Z S， XU C N， WU Y X， et al. Identification of the pathogen causing anthracnose of Chinese dwarf cherry[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2011， 41（5）： 538-541.

[12] 朱建蘭，陳秀蓉. 黃瓜苗期對菌核病抗性篩選研究[J]. 植物保護(hù)，1999，25（6）：10-12.

ZHU J L， CHEN X R. Resistance screening of cucumber varieties to Sclerotinia sclrotiorum[J]. Plant Protection， 1999， 25（6）： 10-12.

[13] 王玉杰，高鳳竹，曹雄，等. 向日葵品種資源對菌核病抗性室內(nèi)鑒定[J]. 中國油料作物學(xué)報，2010，32（4）：540-545.

WANG Y J， GAO F Z， CAO X， et al. Resistance evaluation of different sunflower cultivars to Sclerotinia sclerotiorum[J]. Chinese Journal of Oil Crop Sciences， 2010， 32（4）： 540-545.

[14] 孫溶溶，彭真，程琳，等. 花椰菜菌核病抗性鑒定方法比較及抗病種質(zhì)資源篩選[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2011，37（6）：596-602.

SUN R R， PENG Z， CHENG L， et al. Comparison of identification methods for resistance to Sclerotinia sclerotiorum and screening of resistant materials in cauliflower[J]. Journal of Zhejiang University（Agric. & Life Sci.）， 2011， 37（6）： 596-602.

[15] 婁樹寶，李慶全，田國奎，等. 馬鈴薯種質(zhì)資源晚疫病抗性鑒定與評價[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（12）：11-13.

LOU S B， LI Q Q， TIAN G K， et al. Identification and evaluation of germplasm for resistance to potato late blight[J]. Heilongjiang Agricultural Sciences， 2012（12）： 11-13.

[16] 馬晨燕，袁正杰，楊海河，等. 水稻離體葉片法抗紋枯病接種方法的研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28（10）：1730-1737.

MA C Y， YUAN Z J， YANG H H， et al. Studies on the detached-leaf inoculation method for determination of rice resistance to sheath blight（Rhizoctonia solani）[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis， 2016， 28（10）： 1730-1737.

[17] 鄭章云，楊義，張明海，等. 21果桑品種資源對桑椹肥大性菌核病的田間抗病性評價[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2015，41（6）：1011-1016.

ZHENG Z Y， YANG Y， ZHANG M H， et al. Field resistance evaluation of 21 fruit mulberry germplasm resources against mulberry fruit hypertrophic sclerote disease[J]. Science of Sericulture， 2015， 41（6）： 1011-1016.

[18] 劉勇，許美玲，黃昌軍，等. 高抗煙草花葉病毒的煙草種質(zhì)資源篩選[J]. 種子，2016，35（12）：51-54.

LIU Y， XU M L， HUANG C J， et al. Identification of tobacco germplasm with resistance to Tobacco mosaic virus（TMV）[J]. Seed， 2016， 35（12）： 51-54.

[19] 黃婷，吳云鋒，陳偉，等. 煙草品種對煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒的抗性鑒定[J]. 植物病理學(xué)報，2013，43（1）：50-57.

HUANG T， WU Y F， CHEN W， et al. Identification of the resistance of tobacco varieties to Tobacco mosaic virus（TMV） and Cucumber mosaic virus（CMV）[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2013， 43（1）： 50-57.

[20] 王仁剛，林世鋒，楊志曉，等. 煙草野生種資源對青枯病的抗性[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（12）：71-74.

WANG R G， LIN S F， YANG Z X， et al. Resistance of wild tobacco species to Ralstonia solanacoarum[J]. Guizhou Agricultural Sciences， 2016， 44（12）： 71-74.

[21] 許文，劉勇，姬廣海，等. 煙草青枯病苗期抗性鑒定的漂浮池恒溫水培接種法研究[J]. 中國煙草科學(xué)，2013，34（2）：45-48.

XU W， LIU Y， JI W H， et al. Floating pool water inoculation method for tobacco resistance identification to bacterial wilt[J]. Chinese Tobacco Science， 2013， 34（2）： 45-48.

[22] 王仁剛，楊志曉，林世鋒，等. 煙屬野生種資源黑脛病抗性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（15）：99-102.

WANG R G， YANG Z X， LIN S F， et al. Resistance of wild tobacco species to Phytophthora parasitica var. nicotianae[J]. Jiangsu Agricultural Sciences， 2017， 45（15）： 99-102.

[23] 向世鵬，胡日生，周向平，等. 煙草種質(zhì)資源黑脛病抗性鑒定及親緣關(guān)系SSR分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，2016，31（S1）：156-161.

XIANG S P， HU R S， ZHOU X P， et al. Identification of resistance to black shank disease of tobacco gerplasm resources and analysis of genetic relationship of SSR[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 2016， 31（S1）： 156-161.