王 領， 趙一蔚， 任培樂， 劉蕾娜， 楊 盼， 李 靜， 雷冬玉， 聶永梅

(新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學教研室， 烏魯木齊 830011)

心血管病的病理基礎主要是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)，嚴重危害人類健康[1-2]。AS的發(fā)病機制尚未完全明確。趨化因子在動脈粥樣硬化早期的中心事件中起關鍵作用，即外周血單核細胞向損傷部位的動脈壁內膜遷移、聚集、粘附及活化[3]。趨化因子能夠將免疫細胞吸引到特定位置,根據(jù)N尾部保守半胱氨酸的數(shù)目和位置，趨化因子可分為4個亞家族：CC，C，CXC和CX3C[4]。不規(guī)則趨化因子(Fractalkine，F(xiàn)KN)又稱為CX3CL1，目前已知是CX3C亞家族的唯一成員[4]，兼具有趨化和粘附的特征，主要表達在活化的內皮細胞，與多種炎癥性疾病相關[2]。FKN的受體是CX3CR1，它是G-蛋白偶聯(lián)受體家族中的成員。Wang等[3]的研究表明FKN主要在活化的內皮細胞上表達，活化的內皮細胞釋放FKN與其受體CX3CR1結合后，加強自然條傷(NK)細胞的殺傷力，損傷血管內皮細胞，同時使血管內皮細胞趨化和黏附外周血中單核細胞、淋巴細胞，進而促使AS的形成[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在低剪切應力作用下內皮細胞上CX3CR1表達增加，但在內皮細胞上FKN是如何影響CX3CR1的表達鮮見報道[6]。本研究擬用MTT、qRT-PCR和Western-blot的分子生物學實驗方法，探討FKN對內皮細胞CX3CR1表達的影響，進而為研究動脈粥樣硬化性疾病的發(fā)病機制提供新的切入點。

1 材料和方法

1.1材料EAhy.926細胞株購置于中科院上海細胞庫，重組人fractalkine(美國peprotech)，胎牛血清(美國Gibco)，0.25%胰酶、雙抗、M199購置于美國Hyclone,MTT(四噻唑藍)(武漢博士德)，BSA蛋白定量試劑盒、RAPA裂解液購置于美國Thermo，兔抗人CX3CR1(美國Abcam)，山羊抗兔IGg(武漢Elabscience)。

1.2方法

1.2.1 采用MTT方法挑選出FKN對人臍靜脈內皮細胞的最佳藥物作用濃度 選取不同濃度的FKN作用于人臍靜脈內皮細胞株EAhy.926，根據(jù)細胞吸光度，從0、12.5、25、50、100ng/mL中挑選出人臍靜脈內皮細胞的FKN最佳作用濃度。

1.2.2 不同濃度FKN 培養(yǎng)24 h 的人臍靜脈內皮細胞中CX3CR1蛋白表達觀察 取EAhy.926細胞(對數(shù)生長期)，稀釋細胞密度至4×105/mL，孔板中接種，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。饑餓12 h后，依次加入終濃度為0、12.5、25、50、100、200 ng/mL 的FKN 繼續(xù)培養(yǎng)24 h[7]，每組設3 個復孔，24 h后收集細胞至EP管中。每組加100 μL裂解液，冰上裂解10 min，混勻，重復3次，12 000 r/min 離心10 min，取上清，用12%的 SDS-PAGE 分離膠電泳，分離蛋白質，電泳后將PAGE 凝膠上的蛋白轉至PVDF 膜上(100 V, 90 min)。取膜，8%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗4℃孵育10～12 h， TBST 洗3 次，加入二抗室溫孵育2 h， TBST 洗3 次，ECL 法顯色，內參為GAPDH。各組CX3CR1 表達量以CX3CR1條帶灰度值與GAPDH 灰度值之比所做的柱形圖表示，做3 次重復實驗，取平均值。

1.2.3 25 ng/mL的FKN作用不同時間后人臍靜脈內皮細胞中CX3CR1 mRNA 表達觀察 根據(jù)“1.2.2”項的實驗結果確定FKN作用濃度為25 ng/mL，加入25 ng/mL的FKN培養(yǎng)內皮細胞，培養(yǎng)0、2、4、8、12、16、24、48 h后，提RNA，反轉錄成cDNA，5倍稀釋后，qRT-PCR檢測CX3CR1 mRNA表達情況。CX3CR1上游引物：5′-ACATCGTGGTCTTTGGGACT-3′，CX3CR1下游引物：5′-GACACTCTTGGGCTTCTTGC-3′；β-actin上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，β-actin下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTTAGAAGCA-3′，25 μL反應體系上機。PCR 的反應條件為：預熱50℃，2 min；然后94℃，3 min；94℃，30 s；57℃，30 s；72℃，30 s ，40個循環(huán)。

1.2.4 25 ng/mL的FKN 作用不同時間后人臍靜脈內皮細胞中CX3CR1蛋白表達觀察 加入25 ng/mL的FKN培養(yǎng)內皮細胞0、2、4、8、12、24、48 h后，PBS洗3遍，提蛋白質，用Western-blot方法檢測CX3CR1 蛋白表達情況。

2 結果

2.1FKN對EAhy.926細胞增殖的影響分別用0、12.5、25、50、100 ng/mL 5個濃度的FKN刺激EAhy.926細胞，根據(jù)吸光度篩選出EAhy.926最佳藥物濃度為25 ng/mL, 見圖1。

(與0 ng/mL FKN濃度組比較， *P<0.05)

2.2FKN的不同濃度刺激內皮細胞24hCX3CR1蛋白表達量比較用不同濃度 FKN刺激內皮細胞24 h，Western-blot結果顯示在25 ng/mL FKN刺激濃度時內皮細胞CX3CR1蛋白表達量最高，見圖2。

(與0 ng/mL FKN濃度組比較， *P<0.05)

2.3FKN(25ng/mL)刺激EAhy.926細胞不同時間對CX3CR1mRNA表達量比較用25 ng/mL FKN連續(xù)刺激內皮細胞0、2、4、8、16、12、24、48 h，qRT-PCR結果顯示25 ng/mL的FKN刺激內皮細胞8 h，內皮細胞 CX3CR1 mRNA表達升高，見圖3。

(與0 h組比較， *P<0.05)

2.4FKN(25ng/mL)刺激EAhy.926細胞不同時間對CX3CR1蛋白表達量比較觀察FKN作用時間對細胞的蛋白表達產(chǎn)生影響，因此用25 ng/mL FKN連續(xù)刺激內皮細胞 0、2、4、8、12、24、48 h， Western-blot結果顯示25 ng/mL的FKN刺激內皮細胞2 h，內皮細胞CX3CR1蛋白表達升高，24 h達到高峰，見圖4。

(與0 h組比較， *P<0.05)

3 討論

FKN可分為膜結合型和分泌型2種分子形式，分別誘導外周血白細胞的游走和黏附[8]?？扇苄訤KN對表達CX3CR1的T細胞、單核細胞具有強效的趨化作用[8]，并且膜結合型FKN可幫助血管壁黏附T細胞、單核細胞，因此FKN同時具有細胞間黏附分子和趨化因子的作用[9]。White等[10]用血清誘導健康捐獻者的人單核細胞的自發(fā)凋亡，分別培養(yǎng)于FKN、無血清培養(yǎng)基和胎牛血清的環(huán)境中，只有FKN能以劑量依賴性方式促進單核細胞增殖。FKN在穩(wěn)態(tài)和炎癥條件下促進細胞增殖[11]。FKN在內皮細胞上少量表達，在活化的內皮細胞大量表達[4]，同樣可對內皮細胞的增殖產(chǎn)生影響。本研究表明，25 ng/mL的FKN作用于內皮細胞能有效促進細胞增殖。此外有研究表明，F(xiàn)KN/CX3CR1能促進胰腺癌細胞的增殖[12]。

受體和配體結合具有高度親和力、飽和性、特異性的特點[13 ]。受體的最基本特點是特異性，它保證信號的正確轉導[13 ]。CX3CR1是FKN的唯一受體，F(xiàn)KN則是CX3CR1的配體[3]。在apoE敲除的動脈粥樣硬化的小鼠中阻斷FKN/CX3CR1結合能有效抑制動脈粥樣硬化的形成[14]。而將FKN cDNA 轉染至內皮細胞中，結果發(fā)現(xiàn)NK 細胞對表達FKN的血管內皮細胞殺傷和黏附能力明顯增加[15]，用抗體或可溶性FKN阻斷血管內皮細胞與NK 細胞的結合后，血管內皮細胞損傷受到抑制[15]。進一步研究證實CX3CR1可以介導單核細胞向損傷的內皮快速浸潤[16]，從而促進動脈粥樣硬化斑塊的形成。此外，在小鼠應用CX3CR1拮抗劑可以有效抑制動脈粥樣硬化的形成[17]。上述研究表明FKN/CX3CR1在促進動脈粥樣硬化的形成中的作用。但是CX3CR1 作為FKN的特異性受體[9]是如何受FKN的影響而促進動脈粥樣硬化的形成鮮見報道。本研究觀察25 ng/mL FKN作用于人臍靜脈內皮細胞 24 h后，內皮細胞CX3CR1的蛋白表達最高，表明CX3CR1和FKN的結合在25 ng/mL的濃度點到達飽和。此外本研究用25 ng/mL FKN作用于人臍靜脈內皮細胞不同時間，觀察到內皮細胞CX3CR1蛋白的表達量在2 h明顯增加，在24 h達頂峰，且呈時間依賴性，在48 h內皮細胞CX3CR1蛋白表達量開始下降，表明在時間點上，F(xiàn)KN和CX3CR1的結合同樣有飽和性。同時，本研究結果說明CX3CR1受到FKN刺激8 h，mRNA表達達高峰，而蛋白表達在24 h時達高峰，CX3CR1的蛋白水平表達滯后于mRNA水平。綜上所述，F(xiàn)KN能調控內皮細胞CX3CR1的表達，且由于 FKN 獨特的結構和功能，因此深入探索FKN/CX3CR1 在內皮細胞炎癥反應中的作用，將為治療動脈粥樣硬化性疾病提供新的靶點。

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