胡春榮 杜欣娜 李鳳君 金藝華 張 虎 馬利峰

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154007)

中性內(nèi)肽酶(NEP)是腦內(nèi)最重要的天然β淀粉樣肽(Aβ)降解酶，是影響腦內(nèi)Aβ分解代謝速率的限制因素〔1〕。NEP可以降解或滅活許多生物活性肽。在腦中，NEP表達于神經(jīng)元的突觸前膜和突觸后膜，主要分布于黑質(zhì)紋狀體通路及海馬等易于形成老年斑的區(qū)域，在Aβ的水解過程中發(fā)揮關(guān)鍵酶的作用。NEP被認為是調(diào)節(jié)腦內(nèi)淀粉樣前體蛋白(APP)分解代謝的關(guān)鍵酶〔2〕。盡管如此，仍舊缺乏NEP相互作用蛋白質(zhì)的整體認識，本文通過數(shù)據(jù)庫查詢與NEP相互作用的所有蛋白質(zhì)，通過基因本體(GO)和KEGG分析較為全面地認識NEP及其相互作用的蛋白質(zhì)的功能。

1 資料與方法

1.1查找與NEP相互作用的蛋白質(zhì) 利用蛋白之間相互作用數(shù)據(jù)庫PINA2(http://cbg.garvan.unsw.edu.au/pina/)查找與NEP相互作用的蛋白質(zhì)。

1.2在線軟件SRING分析與NEP結(jié)合蛋白質(zhì)之間相互作用的網(wǎng)絡(luò) 將上述得到的蛋白列表，輸入STRING中，進行蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。

1.3GO和KEGG分析 利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)對上述蛋白列表進行GO和KEGG信號通路分析。

2 結(jié) 果

2.1與NEP結(jié)合的蛋白質(zhì)的生物學(xué)過程(GO分析) 與NEP結(jié)合的蛋白集合參與翻譯起始、多肽代謝途徑、細胞內(nèi)蛋白定位、胞內(nèi)運輸、RNA分解代謝等生物學(xué)過程(見圖1)。

圖1 與NEP相互作用的蛋白質(zhì)參與的生物學(xué)過程

2.2與NEP結(jié)合的蛋白質(zhì)的分子功能(GO分析) 與NEP結(jié)合的蛋白集合主要具有蛋白結(jié)合、核酸結(jié)合、酶結(jié)合、單鏈DNA結(jié)合、激酶結(jié)合等結(jié)合功能(見圖2)。

圖2 與NEP相互作用的蛋白質(zhì)的分子功能

2.3與NEP結(jié)合的蛋白質(zhì)的細胞定位(GO分析) 與NEP結(jié)合的蛋白主要定位于細胞外秘體、胞質(zhì)部分、核糖體、胞內(nèi)細胞器、髓鞘等部位(見圖3)。

圖3 與NEP相互作用的蛋白質(zhì)的細胞定位

2.4KEGG 信號通路分析 與NEP結(jié)合的蛋白主要參與帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)、吞噬體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、cGMP-PKG信號通路等(見圖4)。

圖4 與NEP相互作用的蛋白質(zhì)參與的信號通路

3 討 論

NEP可以在疏水性殘基的氨基側(cè)切割肽，并使幾種肽類激素失活，包括胰高血糖素、腦啡肽、P物質(zhì)、神經(jīng)降壓素、催產(chǎn)素和緩激肽，分子量約為100 kD，屬于Ⅱ型跨膜糖蛋白。該蛋白是常見的急性淋巴細胞白血病抗原，是人類急性淋巴細胞白血病診斷中的重要細胞表面標(biāo)志物。然而，該蛋白質(zhì)不限于白血病細胞，并且在多種正常組織中發(fā)現(xiàn)。它是腎臟中特別豐富的糖蛋白，其存在于近端小管和腎小球上皮的刷子邊緣上。在腦中，大腦部分錐體神經(jīng)細胞、小腦和脊髓分子細胞層、部分神經(jīng)膠質(zhì)細胞，腦脊液都可檢測到其存在〔3〕。本文結(jié)果顯示，NEP結(jié)合蛋白可以定位在細胞的多個部位，且部分蛋白可以隨外泌體分泌出細胞，這一結(jié)果很重要，提示NEP結(jié)合蛋白可能經(jīng)外周循環(huán)到達比較遠的位置起作用。

近年來，關(guān)于內(nèi)源性Aβ降解酶類的研究一直在進行，也取得了一定進展。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種內(nèi)肽酶具有降解Aβ的活性。AD患者腦內(nèi)在易發(fā)生Aβ沉積的區(qū)域，表現(xiàn)為NEP mRNA及其表達產(chǎn)物降低,神經(jīng)變性斑塊部位NEP活性較弱〔4〕，表明NEP在清除腦內(nèi)Aβ過程中可能起著重要作用，提示NEP可以作為AD藥物研發(fā)及臨床治療的新靶點。本結(jié)果也顯示，NEP結(jié)合蛋白參與AD和PD的疾病過程。任凱等〔5〕人證明NEP可以降解Aβ，可以保護由Aβ沉積造成的神經(jīng)細胞凋亡。與此類似的是，張靜等〔6〕認為NEP對Aβ25～53誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞損傷保護作用可能與凋亡相關(guān)基因有關(guān)。神經(jīng)干細胞(NSCs)經(jīng)基因工程高表達NEP后，移植進入AD小鼠腦內(nèi)，結(jié)果不僅增強了突觸的可塑性，而且改善了AD的病理狀態(tài)〔7〕。另外，Lin等〔8〕研究人員首次將外源NEP mRNA經(jīng)納米膠束引入大腦內(nèi)，治療腦部疾病，結(jié)果顯示可以促進Aβ的清除，開創(chuàng)了基于NEP mRNA治療的新紀元。本文結(jié)果顯示，NEP結(jié)合蛋白主要表現(xiàn)為與蛋白、核酸及酶類結(jié)合，參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位、多肽和RNA降解、大分子代謝。這也幫助我們在整體上認識NEP主要通過降解作用，降低有害多肽水平，實現(xiàn)AD的預(yù)防和治療。另外，本文發(fā)現(xiàn)NEP結(jié)合蛋白還可以促進血管緊張素的成熟，為心力衰竭和高血壓等心血管疾病的預(yù)防和治療提供新視角。

最后，關(guān)于NEP結(jié)合蛋白的細胞定位分析顯示部分蛋白可以參與到細胞外泌體中，但是NEP本身并不是一種分泌蛋白〔8〕。那么NEP是否可以通過某種方式到細胞外發(fā)揮作用需要進一步研究和確認。鑒于腦內(nèi)Aβ可以轉(zhuǎn)運到外周循環(huán)中，達到靶器官進行降解，是否可以考慮通過某種手段增加外周循環(huán)或靶器官中的NEP水平，加速Aβ降解，從而間接降低腦內(nèi)Aβ水平，從而預(yù)防和治療AD，值得進一步探討。

1Bacskai BJ,Kajdasz ST,McLellan ME,etal.Non-Fc-mediated mechanisms are involved in clearance of amyloid-beta in vivo by immunotherapy 〔J〕.J Neurosci,2002;22(18):7873-8.

2Caccamo A,Oddo S,Sugarman MC,etal.Age and region dependent alterations in Aβ degrading enzymes:implications for Aβ-induced disorders〔J〕.Neurobiol Aging,2005;26(5):645-54.

3蔡大勇.中性內(nèi)肽酶在神經(jīng)疾病中的病理生理作用〔J〕.中國老年保健醫(yī)學(xué)雜志,2003;1(3):35-40.

4Magavi SS,Leavitt BR,Macklis JD.Induction of neurogenesis in the neocortex of adult mice〔J〕.Nature,2010;405(6789):951-5.

5任 凱,崔云燕,邵世濱,等.慢病毒介導(dǎo)的中性內(nèi)肽酶對Aβ誘導(dǎo)的SK-N-SH細胞凋亡的影響〔J〕.中國病理生理雜志,2008；24(12):2470-4.

6張 靜,王 坤,楊玲玲,等.腺病毒介導(dǎo)的NEP基因?qū)β25-35誘導(dǎo)的SK-N-SH細胞凋亡的抑制作用〔J〕.山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2010;48(3):48-52.

7Blurton-Jones M,Spencer B,Michael S,etal.Neural stem cells genetically-modified to express neprilysin reduce pathology in Alzheimer transgenic models〔J〕.Stem Cell Res Ther,2014;5(1):46.

8Lin CY,Perche F,Ikegami M,etal.Messenger RNA-based therapeutics for brain diseases:an animal study for augmenting clearance of beta-amyloid by intracerebral administration of neprilysin mRNA loaded in polyplex nanomi celles〔J〕.J Control Release,2016;235:268-75.