黃西梅，黃金山，李佳榮，盧蓮珍

（1.廣西百色市右江區(qū)動物疫病預防控制中心，百色 533000；2.百色農(nóng)業(yè)學校，百色 533000）

2017年，按農(nóng)業(yè)部的疫情通報，隨著家禽高致病性的H7N9流感病毒株的出現(xiàn)，陸續(xù)有雞群感染高致病性H7N9流感病毒引起大量的死亡，高致病性H7N9流感呈現(xiàn)出區(qū)域性流行的態(tài)勢。H5亞型高致病性禽流感的流行趨勢總體平穩(wěn)，未出現(xiàn)大范圍的暴發(fā)，但仍有局部散發(fā)疫情的發(fā)生。H5和H7亞型禽流感在我國同時流行且流行毒株復雜多樣，嚴重威脅著我國家禽養(yǎng)殖和公共衛(wèi)生的安全，使得疫病防控形勢更加嚴峻。

目前，疫苗免疫是預防和控制禽流感發(fā)生的最有效途徑，而免疫后抗體水平的高低是評估實際免疫效果的重要指標[1]。

右江區(qū)為了抓好家禽H7N9防控，于2017年8月開始推出使用禽流感（H5+H7）二價滅活苗[2]，為了掌握禽流感（H5+H7）二價滅活苗在右江區(qū)當?shù)丶仪萜贩N的不同注射部位產(chǎn)生的免疫應答和抗體消長情況，提供可操作的免疫方法和免疫程序。特進行本次試驗研究，供廣大養(yǎng)殖戶和動物防疫工作者參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗疫苗

重組禽流感（H5+H7）二價滅活苗（H5N1Re-8株+H7N9 H7-Re1株），批號 2017024，哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司。

1.1.2 試驗雞群分組及免疫次數(shù)情況

選用14日齡右江區(qū)本地土雞 100只，分為2組，其中頸部皮下注射2組，胸部肌肉注射2組。共4個組，試驗期 105 d，詳見表1。

表1 實驗動物分組情況

1.1.3 試驗雞群免疫時間和免疫劑量情況

2017年8月20日對 14日齡的雞2個試驗組進行第1次免疫，免疫劑量按疫苗說明書使用，雞0.3 ml/ 只，9月17日對第 2 組 42日齡的雞進行第2次免疫，免疫劑量按疫苗說明書使用，雞 0.5 ml/ 只，詳見表1。

1.1.4 血清樣品

對第1試驗組雞群1次免疫后，7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、60 d、75 d、90 d 分別隨機采集血清各 50 份，第2組2次免疫后，7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、60 d、75 d、90 d 的 各 組分別隨機采集血清各 50 份，共計血清樣品 900 份。

1.1.5 診斷試劑

HI 試驗禽流感病毒H5亞型（Re－8株）抗原，批號2017001，陽性血清（批號 2016003） HI 試 驗禽 流 感 病 毒 H7 亞 型 抗 原、批號 2017012，陽性血清（批號 2017004）以上試劑均由哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司生產(chǎn)，1% 的非免雞紅細胞自制。

1.2 方法

1.2.1 免疫方法

雞 1～2 組在 14日齡免疫注射疫苗 0.3 ml，雞 2組 42日齡免疫注射疫苗 0.5 ml。

1.2.2 采血部位

21日齡以下的雞鴨在心臟采血，28日齡以上的雞鴨在頸靜脈采血。

1.2.3 檢測方法

按照 GB/T18936—2003 頒布的高致病性禽流感診斷技術方法[3]，用 96 孔微量反應板進行微量血凝抑制（Heamoglutination Inhibition，HI）試驗，試驗用抗原稀釋倍數(shù)為 4HAU，以完全抑制 4HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為 HI 滴度。并按常規(guī)方法設置陰性和陽性對照。

1.2.4 結(jié)果判定

只有陰性對照孔血清滴度不大于 22，陽性對照孔血清誤差不超過 1 個滴度，試驗結(jié)果才有效。

HI 價小于或等于 22判定 HI 試驗陰性；HI 價等于23為可疑，需重復試驗；HI 價大于或等 24為陽性，判為免疫合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫抗體

“H5+H7二價滅活疫苗”免疫后可刺激機體產(chǎn)生良好的免疫應答，進而產(chǎn)生高水平的免疫抗體?！埃℉5+H7）二價滅活疫苗”在一免后 14 d可產(chǎn)生較高的抗體、35 d達到抗體峰值，到 60 d仍維持較高的抗體水平。

2.2 不同免疫次數(shù)的抗體效價分布情況

通過表2 可知，雞二免后H5和 H7抗體合格率為 97.8%和94.4%，而一免的只有 72.22% 和 67.56%，差異極其顯著（P＜0.01）。通過比較不同免疫次數(shù)的抗體效價分布情況，發(fā)現(xiàn)二免后的雞禽流感H5和 H7抗體平均滴度為 8.81 和 7.64 ，比一免高 4.05 個滴度和3.61個滴度，詳見表2、3。

表2 1組免疫后抗體的檢測結(jié)果統(tǒng)計

表3 2組免疫后抗體的檢測結(jié)果統(tǒng)計

免疫后H5N1Re-8株HI抗體消長曲線

免疫后H7N9－Re1株HI抗體消長曲線

通過繪制雞一免和二免后的抗體消長曲線，而雞在一免后 21 d抗體方能合格，并且持續(xù)到一免后 90 d均合格。而在二免后的各個時間點采血，抗體均維持高水平，詳見表2、3。

2.3 兩者的差異

相比之下，H5N1-Re-8株的HI抗體效價比H7N9-Re1株的高，這應與不同病毒2株之間的不同特性有關，所以，在檢測HI抗體進行免疫評估時要注意兩者的差異。

3 討論與結(jié)論

目前，疫苗免疫是防止禽流感暴發(fā)的主要措施。因此，我們進行了禽流感滅活疫苗對雞的抗體產(chǎn)生規(guī)律的探索，為制定禽流感免疫程序和防控禽流感提供科學依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，“H5+H7二價滅活疫苗”免疫應答性顯著，臨床使用安全。家禽進行一次免疫后，21 d起平均抗體滴度能達到 4log2 以上，但總抗體合格率基本在 60%～70%，總平均抗體滴度在 4log2 左右，而二次免疫后，總抗體合格率能達到 95% 左右，平均抗體滴度在 8log2 左右。在對家禽進行首次免疫后由于免疫系統(tǒng)是初次應答，加上母源抗體的干擾，因而抗體效價普遍低；由于在首次免疫后，機體對此種疫苗已具有免疫記憶，當再次用此種疫苗進行加強免疫時，機體可迅速產(chǎn)生比上次免疫更多的抗體，故抗體的效價普遍較高。但在生產(chǎn)中：一方面，很多養(yǎng)殖戶防疫意識不強，認為由于飼養(yǎng)周期短，免疫過一次就可以達到預防目的，對防疫人員進村入戶開展二免不配合不支持，產(chǎn)生抵觸情緒；另一方面，在給家禽注射疫苗時，由于抓捉和注射疫苗時疼痛與疫苗的副作用，家禽應激反應很大，可導致生產(chǎn)性能下降和飼養(yǎng)成本的增加。家禽只進行一次免疫，必然造成抗體滴度較低的現(xiàn)象，難以保護家禽群體，潛在受野毒攻擊暴發(fā)疫情的威脅。應加大對養(yǎng)殖戶和防疫員的培訓力度，強化防疫意識，確保免疫質(zhì)量。結(jié)合本試驗研究結(jié)果，推薦右江區(qū)在14日齡首次免疫禽流感（H5+H7）二價滅活苗（H5N1Re-8株+H7N9 H7-Re1株），頸部皮下注射雞 0.3 ml，42日齡二次免疫禽流感（H5+H7）二價滅活苗（H5N1Re-8株+H7N9 H7-Re1株），頸部皮下注射雞 0.5 ml，使雞群在較長時間內(nèi)保持較高的抗體水平。鑒于（H5+H7）二價滅活疫苗”剛剛推出使用，需要對其免疫效果加強評估。

[1] 吳庭才，張春杰，郭務鵬,等．禽流感母源抗體消長規(guī)律和免疫保護抗體臨界值的測定[J]．廣東畜牧獸醫(yī)科技，2007，32（3）：24-28．

[2] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，農(nóng)業(yè)部《關于切實做好廣東廣西H7N9免疫工作的通知》（農(nóng)辦醫(yī)[2017]23號）．

[3] GB/T18936．高致病性禽流感診斷技術[S]．北京:中國標準出版社，2003．

[4] 刑清潔，景建江，楊雪珍,等．H5+H7禽流感疫苗免疫抗體檢測試驗報告[J]．今日畜牧獸醫(yī)，2018（1）：46．