吳剛 張志江 黃亞冬 王冬浩 李永仁 梁健

血細胞是貝類細胞免疫的承擔者，直接參與異物的吞噬、包囊、免疫黏附、傷口修復等過程[1]，同時能夠合成和釋放多種水解酶、抗菌肽、細胞因子類似物、調(diào)理素、凝集素等免疫因子，是體液免疫的供給者[2]。

關于貝類血細胞的研究開始于1934年，興盛在上世紀70年代中期，主要研究血細胞的形態(tài)、結構、功能，了解貝類的防御機制，以便抵御當時寄生蟲和病菌泛濫引起的大量死亡情況[3]。隨著研究的深入，學者們所用方法不同導致血細胞的分類命名存在巨大的差異，目前為止，貝類的血細胞分類都沒有形成一個統(tǒng)一的標準。本文通過引用國內(nèi)外相關文獻，對目前研究貝類血細胞分類的幾種技術方法做出闡述，列舉出一些常見經(jīng)濟貝類血細胞的種類名稱，并簡單介紹其形態(tài)、結構及功能，為以后貝類非特異性免疫防御相關研究提供基礎。

1 貝類血細胞分類研究技術

早期的貝類血細胞分類研究主要是通過光學或電子顯微鏡的直接觀察，根據(jù)血細胞內(nèi)部細胞器的形態(tài)、顆粒物質(zhì)的有無以及細胞外部的形態(tài)結構、運動方式、血細胞發(fā)生等來進行分類。隨著組織化學染色方法的成熟和發(fā)展，由于血細胞內(nèi)不同物質(zhì)對染色劑的親和性不同而呈現(xiàn)顏色上的差異，為血細胞分類提供了新的研究方法。近些年來，流式細胞術、單克隆抗體及密度梯度離心等新型技術的應用為貝類血細胞的分類提供更多選擇。

1.1 顯微鏡觀察技術

顯微鏡觀察技術分為普通光學顯微鏡觀察和電子顯微鏡觀察。其中，電子顯微鏡觀察又分為透射電鏡觀察和掃描電鏡觀察。與光學顯微鏡相比，電子顯微鏡是以電子束作為照明源對樣品進行透射或反射，在通過電磁透鏡的多級放大后成像于熒光屏上。

透射電鏡具有高分辨率、高放大倍數(shù)、成像立體豐富等優(yōu)點，但由于其成像原理也存在樣品制備具有破壞性、電子束直接轟擊樣品表面、需真空環(huán)境及采樣率低等缺點。透射電鏡觀察貝類血細胞這種細胞密度低、易凝集、形態(tài)結構多樣的懸浮游離細胞時，常規(guī)的樣品制備條件就不太適合。劉靜等[4]從取樣方法、瓊脂包埋方式和鋨酸固定時間等方面找到了適合菲律賓蛤仔血細胞透射電鏡的樣品制備方法，指出用固定液潤洗過的注射器收取血淋巴液能有效防止凝集顯現(xiàn)產(chǎn)生，同時采用離心式的瓊脂包埋方法能最大限度地減少血細胞的丟失，并且鋨酸固定2 h得到的樣品制備效果最佳。

掃描電鏡分辨率高、觀察景深大，可直接觀察樣品的表面結構，圖像富有立體感、真實感，除了能顯示一半樣品表面的形貌外，還能將樣品微區(qū)范圍內(nèi)的化學元素與光、電、磁等性質(zhì)的差異以二維圖像形式顯示出來，并可用照相方式拍攝圖像[5]。

總之，透射電鏡常用于觀察普通顯微鏡不能分辨的細微結構，掃描電鏡則主要用于觀察物體表面的形貌特征。有時兩者配合可以得到較為全面的分析結果。

1.2 組織化學染色技術

組織化學染色技術是利用一些特殊的染色物質(zhì)可與細胞的某種成分發(fā)生反應而特異性附著顏色的原理，對這種成分進行定性和定位分析的技術[3]。此方法可以通過選擇不同的染色劑幾乎可以區(qū)分細胞內(nèi)各種成分，如：AB-PAS染色法可以顯示糖類；汞溴酚藍染色法可以顯示蛋白質(zhì)；蘇丹黑B染色法可以顯示脂肪類；Feulgen染色法顯示DNA等等。

1.3 流式細胞技術

流式細胞術是一種對快速直線流動狀態(tài)中的單列細胞或生物顆粒進行逐個、多參數(shù)、快速定性、定量分析或分選的技術，具有檢測速度快、測量參數(shù)多、采集數(shù)據(jù)量大、分析全面、分選純度高、方法靈活等特點，已經(jīng)成為近代科學研究中的熱門[6]。流式細胞儀是以流式細胞術為核心技術，將經(jīng)過熒光染色的待測細胞制成單細胞懸液，在鞘液的包被下單行排列，以激光束作為激發(fā)光源垂直照射單行流動的細胞，對它的散射光和攜帶的熒光進行探測，從而完成細胞分析和分選。

1.4 單克隆抗體技術

單克隆抗體技術是依據(jù)抗原抗體具有特異性結合的特點，具有特異性的抗體與血細胞膜上抗原決定部位結合而反映出血細胞的不同類別及其免疫功能[7]。

1.5 密度梯度離心技術

密度梯度離心一般是純化病毒的一種常用方法[8-9]。原理是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度介質(zhì)的某些特定位置中而形成不同區(qū)帶的分離方法[10]。優(yōu)點是分離出來的細胞或病毒仍有很好的活性，廣泛用于組織病理學研究中，近幾年在貝類血細胞的分類和功能領域得到應用。以往主要采用氯化銫、蔗糖和多聚蔗糖作為梯度介質(zhì)進行離心，但由于這幾種介質(zhì)的黏度高時滲透壓也會處于較高水平，會對部分分離的目標病毒或細胞產(chǎn)生毒性，因此這種介質(zhì)純化出來的病毒或細胞需要進行透析或稀釋才能應用于后續(xù)研究。張輝等[10]人使用高親水性、高密度、低黏度的碘克沙醇作為介質(zhì)進行梯度離心取得良好效果。

2 貝類血細胞分類

不同學者使用的研究技術手段以及研究對象不同，導致對貝類血細胞的分類命名存在一定差異（見表1）。

顯微鏡觀察法主要是根據(jù)血細胞的形態(tài)進行分類，如陳全震等[11]通過透射電鏡觀察皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）血細胞的超微結構，將其分為5種類型，分別為：大顆粒細胞、小顆粒細胞、特殊顆粒細胞、透明細胞和淋巴樣細胞。并根據(jù)細胞核的形態(tài)和細胞質(zhì)中的細胞器結構特征判斷，大、小顆粒細胞是同一類細胞的不同發(fā)育階段，是由特殊顆粒細胞發(fā)育而來的。透明細胞和淋巴細胞則是兩類分化完全的細胞；Nakayama等[12]使用光鏡和電鏡將紅番硨磲（Tridacna crocea）的血細胞分為3類，分別為：細胞內(nèi)含有直徑大約0.6μm顆粒的嗜酸性粒細胞，包含有低電子密度和少量高電子密度顆粒并擁有光滑表面的無顆粒細胞，以及細胞內(nèi)填充大量直徑約3μm高電子密度顆粒的類桑葚型細胞；Sahaphong 等[13]應用光鏡和電鏡觀察耳鮑（Haliotis asinine）血細胞后認為可分為顆粒細胞和透明細胞兩類；王江勇等[14]根據(jù)細胞大小、顆粒組成特征等將雜色鮑（Haliotis diversicolor）血細胞分為顆粒細胞和無顆粒細胞。

由于細胞在發(fā)生過程中存在許多中間類型，僅依靠形態(tài)學進行分類具有一定的局限性，而化學染色技術的應用便能很好解決這些問題。韓卓然等[15]通過瑞氏染色法將毛蚶（Scapharca subcrenata）血細胞分為：大透明細胞（12.97±1.22μm）、顆粒細胞（9.98±1.85μm）、小透明細胞（7.60±1.17μm），其中大透明細胞質(zhì)染色較淡，胞質(zhì)內(nèi)側(cè)具有少量顆粒，胞質(zhì)外側(cè)為不規(guī)則的透明區(qū)域，而細胞核區(qū)域存在少量嗜堿性藍紫色顆粒和嗜酸性紅色顆粒。顆粒細胞胞質(zhì)染色深，具有大量大小不一的藍紫色嗜堿性顆粒。小透明細胞胞質(zhì)染色較淺，內(nèi)部無顆?；蚝苌?；李俊輝等[16]使用同樣方法將文蛤（Meretrix meretrix）的血細胞分為大顆粒細胞、小顆粒細胞、透明細胞和淋巴細胞。張劍誠等[17]將皺紋盤鮑血細胞分為顆粒細胞和透明細胞兩大類。

這些年來，采用流式細胞儀對貝類血細胞進行分類研究成為了國外學者普遍認可的方式[18-19]，這種方式分析血細胞的數(shù)量達到每秒鐘幾百個，并且還能在同一時間對血細胞的大小和顆粒性進行分析，避免了血細胞分類的主觀性。潘輝等[20]通過流式細胞術認為西施舌（Coelomactra antiquata）、波紋巴非蛤（Paphia undulata）、雙線紫蛤（Sanguinolaria diphos）的血細胞均可分為透明細胞、小顆粒細胞和大顆粒細胞3個亞群。使用相同方法冼健安等[21]把雜色鮑血細胞也分為上述3個亞群。

密度梯度離心主要應用于對病毒的純化處理，在貝類血細胞分離中的應用還不是很常見，屬于較為新穎的技術方法。在對牡蠣血細胞分類研究中，Xue 等[22]就通過該方法將食用牡蠣（Ostrea edulis）血細胞分為3個亞群，分別為顆粒細胞、大透明細胞和小透明細胞。

3 貝類血細胞功能

貝類血細胞的功能包括吞噬、包囊、免疫黏附、傷口修復等，是貝類細胞免疫的主要承擔者[23]。

吞噬作用是貝類血細胞的最主要功能，包括外來物質(zhì)的識別、黏附、攝入、降解、破壞、清除5個基本過程[24]，王文琪等[25]發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）具有吞噬作用的血細胞包括透明細胞、小顆粒細胞、大顆粒細胞；孫虎山[26]、邢婧[27]等均發(fā)現(xiàn)，顆粒細胞擁有最強的吞噬能力，吞噬作用的主要承擔者是具有顆粒內(nèi)含物的細胞；Cheng等[28]指出透明細胞有一定的吞噬能力，但不是主要的，其吞噬能力較弱或不具有吞噬能力。

對于大體積的異物，單個血細胞無法吞噬時，血細胞形態(tài)特化成扁平狀，細胞邊緣相互接合，將異物層層包裹起來，形成包囊[29]。對于血細胞的包囊作用在昆蟲和哺乳動物的研究較多，在水產(chǎn)動物中報道比較少，對貝類的研究就少之更少了。王文琪等[25]發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔血細胞在人為刺激下可發(fā)生包囊作用，包囊的中心一般由發(fā)生了聚合或脫顆粒現(xiàn)象的大顆粒細胞組成，而外層是由發(fā)生了纖維化而彼此連接的小顆粒細胞和無顆粒細胞組成。

大量研究證實哺乳動物血細胞中的紅細胞表面存在眾多免疫相關分子，如CR1（Complement receptor 1）、CR3（Complement receptor 3）、CD58、CD59、IL-8受體、SOD酶等，具有識別、黏附抗原、清除免疫復合物、促進吞噬細胞吞噬、增強NK細胞活性等多種免疫功能[30]。軟體動物雖然低等，但有些種類的貝類是具有紅細胞的，如毛蚶、魁蚶等蚶類，周麗青[31]就發(fā)現(xiàn)魁蚶（Scapharca broughtonii）的紅細胞就具有免疫黏附功能。

由于貝類沒有血小板、特定的凝固因子等，故其傷口修復過程區(qū)別于高等動物。Suzuki[32]等指出珍珠牡蠣的無顆粒細胞會在傷口處增多以清除組織碎片，無顆粒細胞還會特化成細胞鞘，阻止血液流失的同時分泌胞外基質(zhì)作為上皮細胞再生的模板；石安靜等[33]在三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）珍珠囊形成初期觀察到無顆粒細胞形成的多層細胞鞘，并進一步形成珍珠囊上皮。

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