包海霞 ，高 龍 ，2，毛 偉 ，2，劉 博 ，2，錢英紅 ，曹金山 ，2

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部動物臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

前列腺素（prostaglandins，PGs）類化合物是廣泛存在于哺乳動物機體內(nèi)的一種重要的生理活性物質(zhì)，能夠?qū)w內(nèi)多種生殖相關(guān)活性物質(zhì)的分泌產(chǎn)生調(diào)控作用。目前，研究發(fā)現(xiàn)存在于奶牛子宮內(nèi)膜中的PGs主要包括前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2） 和前列腺素F2α（prostaglandin F2α,PGF2α）。 PGE2通過與其受體 EP1、EP2、EP3和 EP4結(jié)合，激活其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)［1］。 張雙翼等［2］研究發(fā)現(xiàn)，奶牛子宮內(nèi)膜組織中EP2和EP4受體的表達(dá)量較高，說明在奶牛子宮內(nèi)膜組織中EP2和EP4受體主要介導(dǎo)了PGE2發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)，在人子宮內(nèi)膜的修復(fù)過程中，PGE2和PGF2α能夠上調(diào)與血管生成有關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、與細(xì)胞增殖有關(guān)的結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor,CTGF）以及具有血管再生作用的白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）的表達(dá)。 由此可知，PGE2和PGF2α在人子宮內(nèi)膜的修復(fù)過程中發(fā)揮重要的作用［3-5］。但是，關(guān)于奶牛子宮內(nèi)膜中PGs是否在其子宮內(nèi)膜組織的修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用的相關(guān)機制研究尚不清楚。因此，該研究以奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞為研究對象，研究了PGE2特異性受體EP2激動劑Butaprost對與血管生成相關(guān)細(xì)胞因子的VEGF表達(dá)的影響，闡明PGE2是否在奶牛子宮內(nèi)膜組織的修復(fù)中發(fā)揮重要的作用，為進(jìn)一步研究PGs對奶牛子宮內(nèi)膜組織的修復(fù)作用提供了一定的理論依據(jù)。

表1 RT-PCR中的受體引物序列及擴增片段大小

1 試驗材料

1.1 奶牛子宮角

奶牛子宮角采集自呼和浩特市北亞清真屠宰場，選取成年健康并且處于發(fā)情前期的奶牛進(jìn)行樣本組織采集。將采集到的子宮角浸泡在含5%雙抗的低溫生理鹽水中迅速帶回實驗室。

1.2 藥品與試劑

DPBS 洗液 （Hyclone）， 鏈蛋白酶（Sigma），DMEM/F12 培養(yǎng)基（GIBCO），青鏈霉素（GIBCO），胎牛血清（ExCell Biolog），胰酶（GIBCO），EP2受體激動劑 Butaprost（Cayman），RNA提取試劑盒(Axygen Scientific），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme），SYBR Ⅱ Premix Ex Taq(TaKaRa)，Actin（碧云天生物技術(shù)有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

2 方法

2.1 奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)

按照文獻(xiàn)［6］中的方法分離培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。

將奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)至第4代用于試驗。觀察活細(xì)胞數(shù)量達(dá)96%以上，采用Cytorecon細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行計數(shù)，以1×105個/mL的濃度接種于6孔板中，置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。

2.2 分組與給藥

按照文獻(xiàn)［6］中的研究結(jié)果選取Butaprost濃度為10-6mol/L。

試驗共分為7組：①對照組（Con），未加藥物作用的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞；②10-6mol/L的Butaprost作用2 h組；③10-6mol/L的Butaprost作用4 h組；④10-6mol/L的Butaprost作用8 h組；⑤10-6mol/L的Butaprost作用16 h組；⑥10-6mol/L的Butaprost作用24 h組；⑦10-6mol/L的Butaprost作用48 h組。

2.3 Butaprost對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中VEGF mRNA表達(dá)的影響

2.3.1 引物設(shè)計合成：利用Primer 6.0通過Gen-Bank上報道的VEGF基因序列設(shè)計合成引物并由Invitrogen公司合成（引物序列見表1）。

2.3.2 總RNA的提取：按照總RNA提取試劑盒提供說明書提取細(xì)胞總RNA。

2.3.3 cDNA的制備：按照Vazyme試劑盒說明書設(shè)定條件獲得cDNA。

2.3.4 RT-PCR檢測奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中VEGF mRNA的表達(dá)

以上述制備的cDNA為模板，利用GenBank合成的引物，通過RT-PCR方法擴增得到目的基因。 反應(yīng)條件是：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，設(shè)置38個循環(huán)，每個樣品設(shè)置5～6個重復(fù)。

3 結(jié)果

結(jié)果見圖1。由圖1可知，EP2受體激動劑Butaprost（10-6mol/L）作用奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞2、4、8、16、24、48 h 后 VEGF mRNA 表達(dá)量與對照組相比，在 8 h 表達(dá)量極顯著增強（P＜0.01，n=6）；在 4、16、24 h 表達(dá)顯著增強（P＜0.05，n=6）；其他時間有所增加，但差異性不顯著。由此可知，EP2受體激動劑Butaprost能夠促進(jìn)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中VEGF基因的表達(dá)。

圖1 BUTAPROST對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)的影響

4 討論

組織修復(fù)是一個非常復(fù)雜的過程，主要經(jīng)歷3個階段：①局部炎癥反應(yīng)階段；②細(xì)胞增殖分化和肉芽組織生成階段；③組織修復(fù)塑形階段。在修復(fù)過程中，許多炎性因子和細(xì)胞生長因子參與其中。VEGF也稱血管通透因子，是一種在血管發(fā)生和血管生成過程中起到關(guān)鍵作用的調(diào)控因子［7-8］。VEGF還可以增強血管的通透性，可以促進(jìn)細(xì)胞遷移、有效地抑制細(xì)胞凋亡［9-11］。除此之外，VEGF還可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖［12］。因此，該研究采用熒光定量PCR技術(shù)檢測了EP2受體激動劑Butaprost對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中VEGF mRNA表達(dá)的影響。研究結(jié)果顯示，Butaprost能夠促進(jìn)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中VEGF mRNA表達(dá)。綜合以上研究結(jié)果可知，奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞內(nèi)源性PGE2可通過與EP2受體結(jié)合，激活其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提高VEGF基因的表達(dá)，進(jìn)而在奶牛子宮內(nèi)膜的修復(fù)過程中發(fā)揮重要的作用。

參考文獻(xiàn)：

［1］NARUMIYA S,SUGIMOTO Y,USHIKUBI F.Prostanoid receptors： structures,properties,and functions ［J］.Physiological Reviews，1999，79（4）：1193-1226.

［2］張雙翼，毛偉，劉博，等.奶牛子宮內(nèi)膜組織體外培養(yǎng)方法的建立及前列腺素E2和F2α受體分布的研究［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2016，37（3）：14-17.

［3］MAYBIN J A,HIRANI N,BROWN P,et al.The regulation of vascular endothelial growth factor by hypoxia and prostaglandin F2αduring human endometrial repair［J］.Journal of Clinical Endocrinology& Metabolism,2011，96（8）： 2475-2483.

［4］MAYBIN J A,BARCROFT J,THIRUCHELVAM U,et al.The presence and regulation of connective tissue growth factor in the human endometrium ［J］.Human Reproduction，2012，27（4）：1112-1121.

［5］MAYBIN J A,HIRANI N,JABBOUR H N,et al.Novel roles for hypoxia and prostaglandin E2in the regulation of IL-8 during endometrial repair ［J］.American Journal of Pathology，2011，178（3）：1245-1256.

［6］都日塔哈拉.EP2和FP受體激動劑對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子β1和血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016：8-10.

［7］CARMELIET P.VEGF as a key mediator of angiogenesis in cancer［J］.Oncology,2005，69（Suppl 3）：4-10.

［8］GRUNEWALD M,AVRAHAM I,DOR Y,et al.VEGF-induced adult neovascularization： Recruitment,retention,and role of accessory cells［J］.Cell，2006，124（1）：175-189.

［9］CASTILLA M A,CARAMELO C,GAZAPO R M,et al.Role of vascular endothelial growth factor （VEGF） in endothelial cell protection against cytotoxic agents［J］.Life Sciences，2000，67（9）：1003-1013.

［10］GERBER H P,MCMURTREY A,KOWALSKI J,et al.Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3′-kinase/Akt signal transduction pathway ［J］.The Journal of Biological Chemistry，1998，273（46）：30336-30343.

［11］KECK P J,HAUSER S D,KRIVI G,et al.Vascular permeability factor,an endothelial cell mitogen related to PDGF［J］.Science ，1989，246（4935）：1309-1312.

［12］JIN K L,ZHU Y H,SUN Y J,et al.Vascular endothelial growth factor （VEGF） stimulates neurogenesis in vitro and in vivo ［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2002，99（18）：11946-11950.