李永聰，黃 俊，廖 花，陳海龍，楊豐宇，賴(lài)怡帆，張旭輝，劉金靈，2，3，4，王國(guó)梁，2，3，4，劉雄倫，2，3，4

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.水稻油菜抗病育種湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4.南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

由子囊寄生菌(Magnaportheoryzae)引發(fā)的真菌性病害-稻瘟病是造成全球水稻大面積減產(chǎn)的主要病害之一，也是目前我國(guó)水稻新品種審定中對(duì)其抗性要求實(shí)行“一票否決制”的病害。稻瘟病在我國(guó)時(shí)有發(fā)生，據(jù)相關(guān)報(bào)道，近年來(lái)年發(fā)生面積在330～570萬(wàn)hm2，稻谷年損失量超過(guò)10億kg[1-3]。目前，生產(chǎn)上主要通過(guò)化學(xué)方法防治稻瘟病，而長(zhǎng)期大量施用殺菌劑，極大地污染了環(huán)境和產(chǎn)品，同時(shí)增加了生產(chǎn)成本。利用抗圃廣、抗性強(qiáng)且持久的抗瘟基因，培育抗稻瘟病水稻品種(組合)應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，被認(rèn)為是控制和防治稻瘟病危害最安全、經(jīng)濟(jì)和有效的策略[4-5]。分子標(biāo)記輔助選擇(Molecular Marker-assisted Selection，MAS)育種，是通過(guò)育種分離群體中個(gè)體的標(biāo)記基因型選擇替代傳統(tǒng)的表型選擇，根據(jù)標(biāo)記基因型之間的差異，間接反映目的基因的有無(wú)，不受環(huán)境、基因顯性上位性等因素的影響，是現(xiàn)代分子育種的重要手段，尤其適合水稻稻瘟病抗性這類(lèi)典型質(zhì)量-數(shù)量性狀的遺傳改良。來(lái)源于小粒野生稻(Oryzaminuta)的廣譜持久抗稻瘟病基因Pi9，已經(jīng)被精細(xì)定位并圖位克隆[6]。

本研究根據(jù)抗性基因Pi9的Nbs2-LRR結(jié)構(gòu)序列設(shè)計(jì)并篩選高效且特異性好的多態(tài)DNA分子標(biāo)記，應(yīng)用MAS技術(shù)和傳統(tǒng)有性雜交育種技術(shù)，開(kāi)展育種實(shí)踐，定向改良優(yōu)質(zhì)兩系水稻恢復(fù)系R389及其雜交種的稻瘟病抗性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

栽培稻與小粒野生稻遠(yuǎn)緣雜交后代中選育出的含有廣譜抗瘟基因Pi9的秈稻品系75-1-127，用作抗瘟基因Pi9的供體親本及自然病圃稻瘟病抗性鑒定和室內(nèi)接種抗譜分析的陽(yáng)性對(duì)照材料；秈稻兩系恢復(fù)系R389，用作抗性基因Pi9的受體親本及輪回親本；R389×75-1-127的高代BC6F1回交群體，用于分析獲選DNA分子標(biāo)記的輔助選擇效率；溫敏兩系不育系P88s，用于配制兩系雜交種P88s×R389和P88s×R389-Pi9；易感稻瘟病水稻品系CO39，用作稻瘟病抗性鑒定的感病對(duì)照材料；作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室收集保存的20份來(lái)自不同稻區(qū)的稻瘟菌菌株(表1)，用于室內(nèi)接種，分析參試材料的稻瘟病抗性和抗菌譜。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及標(biāo)記基因型分析Pi9基因?qū)俚湫偷腘bs-LRR型蛋白編碼基因，含有2個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度分別為5 362，128 bp；cDNA全長(zhǎng)4 772 bp，包括763 bp 5′ UTR、3 099 bp CDS和910 bp 3′ UTR[7]。根據(jù)Pi9基因Nbs2-LRR結(jié)構(gòu)序列信息，開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)基于PCR技術(shù)的DNA分子標(biāo)記，用于Pi9基因供體親本75-1-127與輪回親本R389之間多態(tài)性分析，并利用R389×75-1-127的高代BC6F1回交群體驗(yàn)證獲選標(biāo)記的輔助選擇效率，應(yīng)用獲選高效特異性多態(tài)DNA分子標(biāo)記開(kāi)展分子標(biāo)記選擇育種實(shí)踐。

取供試水稻材料分蘗期的幼嫩葉片約0.2 g置于2.0 mL離心管液氮速凍研磨，CTAB法提取總DNA[8]。用多態(tài)性分子標(biāo)記分別PCR擴(kuò)增各DNA樣品，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%～1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)標(biāo)記基因型。PCR反應(yīng)體系(10 μL)：DNA模板1.0 μL，5 U/μL大連寶生物r-Taq0.1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，0.2 μmol/μL primer pairs 1.0 μL，10×Buffer 1.0 μL，ddH2O 6.7 μL。PCR熱循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。

1.2.2 稻瘟病抗性鑒定及抗菌譜分析 室內(nèi)接種抗性鑒定：接種水稻材料包括R389、抗病對(duì)照75-1-127和感病對(duì)照CO39，接種小種為本實(shí)驗(yàn)室收集保存的20份稻瘟菌菌株(表1)。參試水稻種子經(jīng)選種消毒、干濕催芽后播種于溫室內(nèi)的花卉營(yíng)養(yǎng)土中，期間進(jìn)行常規(guī)管理，不施肥、不打藥，四葉期分別用單孢密度約1×105個(gè)/mL的稻瘟病小種懸浮液進(jìn)行噴霧接種，置于26 ℃、環(huán)境相對(duì)濕度大于90%的黑暗條件下培養(yǎng)24 h，之后于26 ℃、環(huán)境相對(duì)濕度大于90%條件下進(jìn)行12 h黑暗-12 h光照條件交替培養(yǎng)7 d，誘導(dǎo)發(fā)病。發(fā)病等級(jí)調(diào)查及分類(lèi)參照Bonman等[9]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行(0～2級(jí)劃分為抗病類(lèi)型，3～5級(jí)劃分為感病類(lèi)型)，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算R389、75-1-127和感病對(duì)照CO39的抗性頻率(抗性頻率=不致病菌株數(shù)/接種菌株總數(shù)×100%)。

田間病圃抗性表型鑒定：R389×75-1-127的BC6F1回交群體經(jīng)室內(nèi)催芽后于2015年5月14日播種于湖南瀏陽(yáng)大圍山天然病圃，期間進(jìn)行常規(guī)管理、不打農(nóng)藥。6月10日對(duì)個(gè)體苗期的稻瘟病抗感情況進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，并對(duì)抗、感單株葉片隨機(jī)取樣并編號(hào)，提取個(gè)體基因組DNA進(jìn)行標(biāo)記基因型分析，根據(jù)各單株田間抗病表型，結(jié)合單株標(biāo)記基因型的鑒定結(jié)果，檢驗(yàn)獲選DNA分子標(biāo)記的輔助選擇效率；2015年5-6月于自然病圃對(duì)回交BC6F3群體各株系苗瘟抗性進(jìn)行鑒定，9月對(duì)穗瘟抗性進(jìn)行鑒定與評(píng)價(jià)，并根據(jù)基因型鑒定結(jié)果篩選出高抗稻瘟病純系；2016年5-6月于同一天然稻瘟病病圃鑒定雜交種苗瘟抗性，9月鑒定穗瘟抗性。

1.2.3 MAS育種實(shí)踐 MAS回交群體構(gòu)建：以R389為Pi9基因受體親本及輪回親本，75-1-127為Pi9基因供體親本，2010年在長(zhǎng)沙(夏季)溫湯去雄雜交獲得R389×75-1-127的F1種子，2011年在三亞(春季)獲得BC1F1，之后在兩地穿梭加代，于2013年夏季獲得BC6F1高代回交群體。各世代回交群體構(gòu)建過(guò)程中，每代田間種植40～60株，抽穗前隨機(jī)單株編號(hào)，提取DNA樣品分析標(biāo)記基因型，根據(jù)前景選擇(分子標(biāo)記鑒定)和背景選擇(農(nóng)藝性狀考察)結(jié)果，選擇10余個(gè)含有Pi9基因的單株進(jìn)行回交，混合收種構(gòu)成下一代回交群體。

抗病恢復(fù)系培育：2014年夏季對(duì)BC6F1群體中含有Pi9基因的個(gè)體套袋自交，獲得BC6F2群體。2015年進(jìn)一步對(duì)BC6F2單株做標(biāo)記基因型鑒定，獲得Pi9基因的BC6F3純合株系，并根據(jù)病圃抗性鑒定結(jié)果和田間主要農(nóng)藝性狀考察結(jié)果，篩選出優(yōu)良抗病恢復(fù)系。

抗病雜交種培育：2015年8月，選用1個(gè)遺傳背景(主要農(nóng)藝性狀)與受體親本R389非常相似的抗病純系，與兩系溫敏不育系P88s配制P88s×R389-Pi9兩系雜交種，同時(shí)用不育系P88s和受體親本配制P88s×R389對(duì)照雜交種。2016年6-10月，在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園基地(長(zhǎng)沙)進(jìn)行小區(qū)評(píng)比試驗(yàn)，分析改良抗病恢復(fù)系及其雜交種的產(chǎn)量、株高等主要農(nóng)藝性狀。試驗(yàn)實(shí)行隨機(jī)區(qū)組排列，設(shè)置3次重復(fù)，小區(qū)面積15 m2。室內(nèi)催芽后于6月3日播種，7月1日分單株移栽，行距25 cm、株距20 cm，常規(guī)田間管理。每個(gè)小區(qū)定點(diǎn)取10個(gè)株，分單株調(diào)查分析全生育期、株高以及單株有效穗數(shù)、穗粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、千粒質(zhì)量等產(chǎn)量性狀，相關(guān)記載標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[10]。采用Excel和SPSS軟件分別對(duì)所得數(shù)據(jù)平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本水稻的稻瘟病抗性及抗菌譜分析

用20份來(lái)自國(guó)內(nèi)外不同稻區(qū)的代表性稻瘟菌菌株，室內(nèi)活體接種Pi9基因供體親本75-1-127、受體親本R389和感病對(duì)照CO39。結(jié)果表明，供體親本75-1-127及受體親本R389兩者間抗性表現(xiàn)和抗菌譜均存在明顯差異(表1)?？剐曰騊i9供體75-1-127對(duì)18份稻瘟病致病菌菌株擁有良好的免疫能力，表現(xiàn)為高抗，僅對(duì)日本小種KOH和韓國(guó)小種ROR1 2個(gè)小種無(wú)免疫能力，抗性頻率為90.0%，抗譜廣。受體親本R389對(duì)9份菌株表現(xiàn)感病，對(duì)包括KOH、ROR1在內(nèi)的11份菌株(87-4、193-1-1、195-2-2、CHL329、CHL438、CHL506、M2006123A1、RB5、KOH、GUY11、ROR1)表現(xiàn)抗病，抗性頻率為55.0%，抗譜較窄。感病對(duì)照CO39對(duì)所有20份供試菌株均表現(xiàn)感病。另一方面，田間自然病圃抗性鑒定結(jié)果表明，75-1-127表現(xiàn)出高水平苗瘟及穗瘟抗性，而受體親本兩系恢復(fù)系R389高感苗瘟和穗瘟(表1、圖1)。可見(jiàn)，Pi9基因廣譜高抗稻瘟病，在水稻育種實(shí)踐中應(yīng)用前景廣闊；而受體親本R389的稻瘟病抗性差，需要改良。

2.2 高效分子標(biāo)記Ins1-1的建立與應(yīng)用

利用已發(fā)表的Pi9基因序列信息，在其第一個(gè)內(nèi)元序列內(nèi)設(shè)計(jì)了1對(duì)PCR引物(標(biāo)記)Ins1-1(正向序列為5′-GTGGATATTCACCCGTTTCTTGCATG-3′，反向序列為5′-CACGATGATAACTTGGGCTAGGGC

G-3′)，引物覆蓋區(qū)間為該內(nèi)元序列的第360～872 bp。Ins1-1是一個(gè)顯性DNA分子標(biāo)記，在兩親本間多態(tài)性明顯而穩(wěn)定，在抗性基因Pi9供體親本基因組DNA中擴(kuò)增出一條大小為513 bp的明亮條帶，而對(duì)受體親本R389基因組無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)。為驗(yàn)證Ins1-1的輔助選擇效率，對(duì)R389×75-1-127 BC6F1群體中隨機(jī)單株的標(biāo)記基因型與抗瘟表型做了對(duì)應(yīng)分析，結(jié)果表明，其選擇效率為100%(圖2)。利用Ins1-1這個(gè)獲選的高效分子標(biāo)記開(kāi)展分子標(biāo)記輔助選擇育種實(shí)踐，實(shí)現(xiàn)兩系優(yōu)質(zhì)水稻恢復(fù)系R389及其雜交種稻瘟病抗性的定向改良。

圖1 改良恢復(fù)系R389-Pi9及其雜交種的田間病圃抗性表現(xiàn) Fig.1 Blast resistance performance of improved restorer R389-Pi9 and its hybrid in field nursery

菌株Isolate來(lái)源OriginR38975?1?127CO39(CK)87?4湖南RRS110?2湖南SRS318?2湖南SRS193?1?1湖南RRS195?2?2湖南RRSCHL329湖南RRSCHL438湖南RRSCHL440湖南SRSCHL446湖南SRSCHL506福建RRSM2006123A1福建RRSCHL645貴州SRSCHL1743廣東SRSRB4廣東SRSRB5廣東RRSE2007046A2湖北SRSKOH日本RSSGUY11法國(guó)RRSKJ105韓國(guó)SRSROR1韓國(guó)RSS抗性頻率/%55．090．00Resistancefrequency自然病圃抗病性NurseryresistanceSRS

注：R.抗??；S.感病。圖2-3同。

Note：R. Resistant ；S. Susceptible.The same as Fig.2-3.

2.3 改良抗病恢復(fù)系及其雜交種培育

自2010年開(kāi)始，以秈稻抗稻瘟病水稻品系75-1-127為抗性基因供體親本、優(yōu)質(zhì)稻兩系恢復(fù)系R389為Pi9基因受體親本及輪回親本，利用獲選的特異性標(biāo)記Ins1-1在長(zhǎng)沙和三亞兩地進(jìn)行穿梭MAS育種，于2014年夏季獲得R389×75-1-127的BC6F2回交群體，在此基礎(chǔ)上經(jīng)標(biāo)記基因型鑒定，2015年春季獲得26個(gè)含純合Pi9等位基因的高代回交BC6F3株系。2015年于湖南瀏陽(yáng)大圍山稻瘟病病圃對(duì)各株系的苗瘟和穗瘟抗性進(jìn)行鑒定，結(jié)合分子標(biāo)記選擇與產(chǎn)量、株葉型等主要農(nóng)藝性狀的初步分析結(jié)果，從中篩選出1個(gè)高抗稻瘟病且遺傳背景與受體親本R389非常相似的改良恢復(fù)系R389-Pi9(圖1，3)，并用它與溫敏不育系P88s配制兩系雜交種兩優(yōu)389-Pi9。2016年夏季在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園水稻實(shí)驗(yàn)基地(非病圃)進(jìn)行的小區(qū)評(píng)比試驗(yàn)結(jié)果表明，改良的抗病系R389-Pi9及雜交種P88S/R389-Pi9的主要農(nóng)藝性狀及雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)，分別與對(duì)照R389及其雜交種P88S/R389在全生育期、株高、產(chǎn)量構(gòu)成因素等性狀表現(xiàn)上均無(wú)顯著差異(表2)。田間天然稻瘟病病圃抗性鑒定結(jié)果表明，恢復(fù)系R389-Pi9和雜交種兩優(yōu)389-Pi9的苗瘟和穗瘟抗性均達(dá)到高抗水平，而R389和兩優(yōu)389高感苗瘟和穗瘟(圖1)，實(shí)現(xiàn)了定向改良受體恢復(fù)系R389及其雜交種的目標(biāo)。

A.表型鑒定結(jié)果；B.Ins1-1標(biāo)記基因型鑒定結(jié)果：M.DNA ladder；1.75-1-127；2.R389；3～22.R389×75-1-127的BC6F1單株。A. Phenotypic identification result；B. Genotypic identification result by Ins1-1：M.DNA ladder；1.75-1-127；2.R389；3-22.R389×75-1-127 BC6F1 single plants.

A1.R389-Pi9表型鑒定結(jié)果；A2.R389-Pi9 Ins1-1標(biāo)記基因型鑒定結(jié)果：M.DNA ladder；1.75-1-127；2.R389；3～22.R389-Pi9株系內(nèi)隨機(jī)取樣單株；B1.雜交種兩優(yōu)389-Pi9的表型鑒定結(jié)果；B2.雜交種兩優(yōu)389-Pi9的Ins1-1標(biāo)記基因型鑒定結(jié)果：M.DNA ladder；1.75-1-127；2.R389；3.兩優(yōu)389(對(duì)照)；4～24.兩優(yōu)389-Pi9隨機(jī)單株。

A1. Phenotypic identification results of R389-Pi9；A2.Genotypic identification results of R389-Pi9 by marker Ins1-1：M. DNA ladder；1. 75-1-127；2.R389；3-22.Randomly sampled plants from R389-Pi9 family；B1. Phenotypic identification result of the hybrid Liangyou 389-Pi9；B2.Genotypic identification result of Liangyou 389-Pi9 by marker Ins1-1：M.DNA ladder;1. 75-1-127；2.R389；3.Liangyou 389(CK)；4-24. Plants of Liangyou 389-Pi9.

圖3改良恢復(fù)系R389-Pi9及雜交種的表型與基因型鑒定

Fig.3PhenotypicandgenotypicidentificationoftheimprovedrestorerR389-Pi9anditshybrid

3 討論與結(jié)論

稻瘟病菌引起的稻瘟病是危害水稻生產(chǎn)安全和影響稻米米質(zhì)的主要病害之一，由稻瘟病所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)重要性，以及稻瘟病生理小種種族特異性及其在遺傳上的可操作性，稻瘟病菌已逐漸成為研究抗性基因(R gene)與無(wú)毒基因(Avr gene)相互作用的模式真菌[11]。但由于稻瘟病生理小種的多樣性和高度變異性，一定程度上限制了抗性基因和抗性品種的推廣應(yīng)用。因此，選用什么抗性基因進(jìn)行品種改良，也會(huì)因?yàn)榈緟^(qū)的不同而有所差異。作為二期超級(jí)稻兩優(yōu)389的兩系恢復(fù)系389具有株葉形態(tài)好、分蘗能力強(qiáng)、產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu)、抗倒伏能力和抗寒能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但感稻瘟病和白葉枯病[12]，因此，急需改良。Pi9基因是水稻第6號(hào)染色體上Pi2/9位點(diǎn)第1個(gè)被克隆的廣譜持久抗瘟基因，對(duì)來(lái)自13個(gè)國(guó)家的43個(gè)稻瘟菌小種均表現(xiàn)出高水平抗性[6]。本研究利用廣譜抗性Pi9基因開(kāi)展MAS回交育種，定向改良優(yōu)質(zhì)水稻兩系恢復(fù)系R389及其雜交種的稻瘟病抗性，育成了苗期和穗部發(fā)育時(shí)期高抗稻瘟病的改良純系R389-Pi9及兩系雜交種兩優(yōu)389-Pi9。但由于小區(qū)試驗(yàn)田的單一，試驗(yàn)代表性相對(duì)較差，將在此基礎(chǔ)上，一方面，通過(guò)布置多點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證改良恢復(fù)系及其雜交種在我國(guó)不同稻區(qū)的稻瘟病抗性表現(xiàn)；加快測(cè)優(yōu)配組，培育更多抗病強(qiáng)優(yōu)組合應(yīng)用于生產(chǎn)；開(kāi)發(fā)高效、特異性強(qiáng)的InDel共顯性分子標(biāo)記，以彌補(bǔ)應(yīng)用Pi9基因進(jìn)行MAS育種基因型鑒定繁瑣的缺點(diǎn)。另一方面，由于稻瘟病生理小種(菌株)種族特異性及高度變異性，一定程度上限制了現(xiàn)有單一抗性基因(品種)的推廣應(yīng)用。作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)同時(shí)利用具有互補(bǔ)抗圃的抗性基因Pi9、Pigm、Pi47、Pi48、Pi49、Pi2-1、Pi51等廣譜抗瘟基因開(kāi)展MAS育種，育成了大量抗病新材料新品系[13-17]，筆者正在開(kāi)展多基因聚合育種，以期培育出抗譜和適應(yīng)性更廣的新品種(組合)。

表2 改良恢復(fù)系R389-Pi9及其雜交種的主要農(nóng)藝及產(chǎn)量性狀分析Tab.2 Main agronomic and yield traits analysis of the improved restorer R389-Pi9 and its hybrid

注：小寫(xiě)字母表示5%顯著性差異。

Note：Lowercase letter indicates 5% significant difference.

分子標(biāo)記是以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是育種家們?cè)陂L(zhǎng)期的育種實(shí)踐中不斷衍生出來(lái)的，目前廣泛應(yīng)用于構(gòu)建作物遺傳圖譜、定位重要農(nóng)藝性狀基因、分析種質(zhì)資源的遺傳多樣性與鑒定品種指紋圖譜和純度等方面。輔助選擇作為現(xiàn)代育種技術(shù)，相對(duì)傳統(tǒng)育種而言，既高效、經(jīng)濟(jì)，又不受環(huán)境條件影響，而且分子檢測(cè)樣品不受種類(lèi)、植株生長(zhǎng)季節(jié)、部位組織等限制，操作相對(duì)簡(jiǎn)單。但目前利用分子標(biāo)記輔助選擇改良水稻稻瘟病抗性已有大量的研究報(bào)道，閆成業(yè)等[18]采用雜交、回交和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，將抗稻瘟病基因Pi9滲入到Q優(yōu)6號(hào)的父本R1005中，育成了3個(gè)攜帶Pi9基因的株系，抗性較父本明顯增強(qiáng)；姜思達(dá)[19]利用Pi9緊密連鎖的分子標(biāo)記定向改良了黑龍江主栽品種稻花香的稻瘟病抗性，改善了稻花香的品質(zhì)；劉樹(shù)芳等[20]利用與Pi9基因緊密連鎖的分子標(biāo)記結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇改良云粳優(yōu)5號(hào)、云資粳41號(hào)和楚粳28等3份農(nóng)藝性狀優(yōu)良水稻品種的稻瘟病抗性。但是，這些標(biāo)記都是顯性分子標(biāo)記。盡管基于Pi9基因的共顯性分子標(biāo)記也有報(bào)道，如張羽等[21]基于Pi9基因的SNP共顯性分子標(biāo)記，能有效、準(zhǔn)確地開(kāi)展分子標(biāo)記輔助選擇育種；華麗霞等[22]、Tian等[23]基于PCR技術(shù)以及電泳檢測(cè)技術(shù)的Pi2/Pi9的基因特異性共顯性分子標(biāo)記，有效地將Pi2/Pi9與該位點(diǎn)上的其他抗性等位基因及感病等位基因區(qū)分開(kāi)。雖然這些標(biāo)記都能有效地運(yùn)用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，但在不同品種間，選擇效率存在差異。本研究中所獲得的標(biāo)記也屬于顯性分子標(biāo)記，不能有效區(qū)分純合子和雜合子，致使抗病純系的選育周期延長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)室今后將針對(duì)Pi9基因開(kāi)發(fā)出基于PCR技術(shù)的共顯性分子標(biāo)記，以彌補(bǔ)不能一次性區(qū)分純合子與雜合子的不足。

本研究根據(jù)稻瘟病抗性基因Pi9的內(nèi)含子序列信息，開(kāi)發(fā)了一個(gè)高效顯性DNA標(biāo)記Ins1-1，利用該標(biāo)記開(kāi)展分子標(biāo)記輔助選擇育種，成功將Pi9基因?qū)胨净謴?fù)系R389，從26份含Pi9純合等位基因的BC6F3株系中篩選獲得了一個(gè)遺傳背景與受體親本相當(dāng)?shù)母呖沟疚敛〖兿礡389-Pi9，并獲得高抗苗瘟和穗瘟的兩系雜交種兩優(yōu)389-Pi9。

參考文獻(xiàn)：

[1] 龔 偉，李靜波，黃安輝. 7種殺菌劑對(duì)稻瘟病的田間防效研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2016(4)：116.

[2] 劉占領(lǐng)，雷財(cái)林，程治軍，等. 水稻稻瘟病抗性基因定位與克隆研究進(jìn)展[J]. 作物雜志，2007(3)：16-19.

[3] 姜玉英，劉萬(wàn)才，陸明紅，等. 2016年全國(guó)農(nóng)作物重大病蟲(chóng)害發(fā)生趨勢(shì)預(yù)報(bào)[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊，2016(2)：32-33.

[4] Su J，Wang W，Han J，et al. Functional divergence of duplicated genes results in a novel blast resistance genePi50，at the Pi2/9，locus[J]. Theoretical & Applied Genetics，2015，128(11)：2213.

[5] 王 飛，王立廣，潘梅瑤，等. 水稻抗稻瘟病Pigm(t)基因的分子標(biāo)記輔助選擇與利用[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2016，31(1)：51-56.

[6] Liu G，Lu G，Zeng L，et al. Two broad-spectrum blast resistance genes，Pi9(t)andPi2(t)，are physically linked on rice chromosome 6[J]. Molecular Genetics and Genomics，2002，267(4)：472-480.

[7] Qu S，Liu G，Zhou B，et al. The broad-spectrum blast resistance genePi9 encodes a nucleotide-binding site-leucine-rich repeat protein and is a member of a multigene family in rice[J]. Genetics，2006，172(3)：1901-1914.

[8] 宋 敏，張?jiān)茖O，胡衛(wèi)紅. 4種提取水稻基因組DNA方法的比較[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2001，23(1)：74-76.

[9] Bonman J M， Edios T I V，Khin M M.Physiologic specialization ofPyriculariaoryzaein the Philippines[J]. Plant Disease，1986，70(8)：767-769.

[10] 應(yīng)存山. 中國(guó)稻種資源[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，1993：530-531.

[11] Li Y，Zhang X E，Hu S，et al. PKA activity is essential for relieving the suppression of hyphal growth and appressorium formation by MoSfl1 inMagnaportheoryzae[J]. PLoS Genetics，2017，13(8)：e1006954.

[12] 王效寧，孟衛(wèi)東，林尤珍，等. 兩系超級(jí)雜交稻兩優(yōu)389在海南高產(chǎn)制種技術(shù)[J]. 雜交水稻，2010，25(5)：34-35.

[13] 文 婷，梁 毅，江 南，等. 利用Pi9基因序列標(biāo)記輔助選擇改良秈稻稻瘟病抗性[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，38(3)：262-266.

[14] 梁 毅，楊婷婷，譚令辭，等. 水稻廣譜抗瘟基因Pigm緊密連鎖分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及其育種應(yīng)用[J]. 雜交水稻，2013，28(4)：63-68，74.

[15] 曹 志，曾 蓋，郝 明，等. 利用MAS技術(shù)改良水稻兩用核不育系C815S的稻瘟病抗性[J]. 分子植物育種，2015，13(6)：1193-1200.

[16] 行 璇，劉雄倫，陳海龍，等. 分子標(biāo)記輔助選擇Pi9基因改良R288的稻瘟病抗性[J]. 作物研究，2016，30(5)：487-491.

[17] 楊豐宇，李永聰，劉雄倫，等. 分子標(biāo)記輔助選擇改良早秈稻1701的稻瘟病抗性[J]. 分子植物育種，2017，15(6)：2212-2217.

[18] 閆成業(yè)，馬馬渡·剛德卡，蔣勝理，等. 分子標(biāo)記輔助選擇改良雜交水稻Q優(yōu)6號(hào)的稻瘟病抗性[J]. 雜交水稻，2014，29(1)：56-61，66.

[19] 姜思達(dá). 黑龍江省水稻品種稻瘟病抗性基因Pi9的鑒定及稻花香稻瘟病抗性改良[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[20] 劉樹(shù)芳，董麗英，趙國(guó)珍，等. 抗稻瘟病基因Piz-t和Pi9連鎖標(biāo)記開(kāi)發(fā)及在云南粳稻中的應(yīng)用[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，29(4)：721-725.

[21] 張 羽，李厚華，王保軍，等. 稻瘟病抗性基因Pi9的功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2015，30(4)：528-534.

[22] 華麗霞，汪文娟，陳 深，等. 抗稻瘟病Pi2/9/z-t基因特異性分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，2015，29(3)：305-310.

[23] Tian D G，Chen Z J，Chen Z Q，et al. Allele-specific marker-based assessment revealed that the rice blast resistance genesPi2 andPi9 have not been widely deployed in Chinese indica rice cultivars[J]. Rice，2016，9(1)：19.