江 院，王啟亮，解新明，盧小良，張向前

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省草業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

玉米是世界三大糧食作物之一，也是一種重要的飼料作物。墨西哥類玉米(ZeamexicanaSchrad.)又名大芻草，是栽培玉米(ZeamaysL.)的野生近緣種，分蘗力強(qiáng)，遺傳穩(wěn)定，具有熱帶種質(zhì)所特有的基因，雜交親和性好，是玉米品種選育的重要種質(zhì)資源[1-4]。以墨西哥類玉米為供體，以普通玉米為受體構(gòu)建染色體片段導(dǎo)入系組成單片段代換系(SSSLs)文庫，消除遺傳背景干擾[5-6]，可為玉米遺傳改良提供優(yōu)質(zhì)種質(zhì)。單片段代換系在QTL鑒定、基因精細(xì)定位、基因互作效應(yīng)分析及縮短QTL研究與育種事件之間的距離等方面，均具有廣闊的應(yīng)用前景[7-11]，在玉米遺傳育種上具有更高的實(shí)用價(jià)值和廣泛的應(yīng)用范圍[12-13]。

在玉米染色體導(dǎo)入系研究方面，主要集中在玉米抗旱性、抗病性及品質(zhì)改良導(dǎo)入系篩選[14-15]。呂香玲等[16]在近等基因?qū)胂祷A(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了玉米抗甘蔗花葉病毒的主效QTL，為抗病育種提供了重要材料。張書紅[17]構(gòu)建了以優(yōu)良玉米自交系87-1為遺傳背景的綜3導(dǎo)入系，鑒定并初步定位了1個(gè)新的玉米矮花葉病隱性抗病基因，其中有26個(gè)單片段導(dǎo)入系，覆蓋率為15.70%。王幫太[18]利用構(gòu)建的玉米單片段代換系進(jìn)行了玉米產(chǎn)量相關(guān)性狀的QTL鑒定。此外，單片段導(dǎo)入系在水稻遺傳改良研究中也大量應(yīng)用，日本RGP克隆的Hdl、Hd6和Hd3a等抽穗期QTL就是以水稻單片段代換系為試驗(yàn)材料[19-21]。有學(xué)者利用類似材料和方法，還克隆了番茄編碼類胡蘿卜素的等位基因和異構(gòu)酶基因[22-23]。

玉米單片段代換系作為永久作圖群體，是研究QTL的理想材料。在水稻、番茄、大豆、小麥等作物中單片段代換系應(yīng)用研究已有大量報(bào)道[24-28]。目前，玉米的相關(guān)研究主要針對其整個(gè)染色體基因組導(dǎo)入系的構(gòu)建及利用，系統(tǒng)得構(gòu)建玉米某一條染色體單片段代換系的研究尚未見報(bào)道，關(guān)于穗長相關(guān)基因?qū)胂档臉?gòu)建研究也相對較少。同時(shí)以墨西哥類玉米為供體構(gòu)建染色體代換系亦鮮見報(bào)道。

本研究以一年生墨西哥類玉米為供體親本，玉米優(yōu)良自交系鄭58為受體親本，通過雜交、回交和SSR標(biāo)記輔助選擇，構(gòu)建了以自交系鄭58為背景的玉米第10染色體墨西哥類玉米單片段代換系群體，并對第10染色體上穗長QTL進(jìn)行了初步定位。利用墨西哥類玉米的野生近緣種質(zhì)構(gòu)建染色體片段代換系，為玉米品種選育提供了新的育種材料，也為拓寬玉米種質(zhì)遺傳變異基礎(chǔ)提供了一定支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選用玉米自交系鄭58為受體親本，玉米野生近緣種一年生墨西哥類玉米(ZeamexicanaSchrad.)又名大芻草為供體親本。所用BC6F1種子為鄭58和墨西哥類玉米雜交F1經(jīng)過多代回交得到。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 采用MaizeGDB(www.maizegdb.org)公布的在玉米第10染色體上均勻分布的150對SSR分子標(biāo)記作引物，對親本進(jìn)行多態(tài)性篩選。利用存在明顯多態(tài)性的引物進(jìn)行回交世代代換片段的檢測。每對引物之間的平均距離為3.50 cM。DNA提取參照Zhang等[29]的方法。PCR反應(yīng)體系參照Panaud等[30]的方法稍加修改，標(biāo)記檢測參照Li等[31]的方法。

1.2.2 染色體導(dǎo)入系群體的構(gòu)建 本研究利用鄭58自交系和墨西哥類玉米進(jìn)行一次遠(yuǎn)緣雜交后，以鄭58自交系為輪回親本進(jìn)行回交，以高代回交群體BC7F1、BC8F1和BC9F1為材料針對第10染色體進(jìn)行SSR分子標(biāo)記跟蹤輔助選擇(MAS)，構(gòu)建以鄭58為遺傳背景的染色體單片段代換系群體。田間試驗(yàn)在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城寧西試驗(yàn)基地進(jìn)行。具體技術(shù)路線如圖1所示。

圖1 以墨西哥類玉米(大芻草)為供體的玉米第10染色體單片段代換系構(gòu)建圖Fig.1 The procedure for constructing SSSLs on the tenth chromosome by using teosinte as donor parent

1.2.3 導(dǎo)入片段長度的計(jì)算 按Young等[32]提出的方法計(jì)算替換片段的長度。如圖2所示，在不考慮2個(gè)相鄰標(biāo)記區(qū)間發(fā)生雙交換的情況下，當(dāng)染色體上相鄰標(biāo)記的基因型相同時(shí)，就認(rèn)為這2個(gè)標(biāo)記之間的區(qū)段由完全相同的標(biāo)記基因型組成；當(dāng)相鄰標(biāo)記的基因型不同時(shí)，就認(rèn)為這2個(gè)標(biāo)記基因型分別組成這個(gè)區(qū)間的一半。圖2中M為分子標(biāo)記，LMIN為替換片段的最小長度，LMAX為替換片段的最大長度，L為替換片段的估計(jì)長度。替換片段的估計(jì)長度等于最小長度和最大長度的平均值。本試驗(yàn)統(tǒng)一用估計(jì)長度L來度量代換片段的長度。導(dǎo)入片段總長度為所有導(dǎo)入片段長度的累加。覆蓋率為墨西哥類玉米導(dǎo)入片段在第10染色體上覆蓋的百分比。

圖2 代換片段長度計(jì)算的示意圖Fig.2 Schematic of donor segments length calculation

1.2.4 SSSL的穗長QTL檢測 在BC9F1群體中，將含有同一個(gè)SSR標(biāo)記的SSSL單株觀察值作為一個(gè)群體，以10株鄭58自交系單株觀察值作為對照群體。通過t測驗(yàn)比較SSSL與鄭58之間穗長的差異，以α=0.01為閾值，即P≤0.01時(shí)表示代換片段上有穗長QTL存在。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米自交系鄭58與墨西哥類玉米之間多態(tài)性引物的篩選

在玉米第10染色體上選擇分布均勻的150對SSR引物進(jìn)行親本間多態(tài)性篩選，共獲得45對在供體和受體親本間有明顯多態(tài)性差異的SSR分子標(biāo)記引物，平均遺傳距離為12.24 cM。其中在BC7F1群體檢測中選用了35對SSR分子標(biāo)記引物，平均遺傳距離為15.74 cM；在BC8F1群體檢測中選用了40對SSR分子標(biāo)記引物，平均遺傳距離為13.77 cM；在BC9F1群體檢測中選用了45對SSR分子標(biāo)記引物，平均遺傳距離為12.24 cM。各回交群體所用的引物名稱及在第10染色體上的遺傳距離如圖3所示。

A.BC7F1群體所用引物；B.BC8F1群體所用引物；C.BC9F1群體所用引物。A.Indicates the markers using on BC7F1；B.Indicates the markers using on BC8F1；C.Indicates the markers using on BC9F1.

2.2 各回交世代單片段代換系群體的構(gòu)建

2.2.1 BC7F1群體中單片段在第10染色體上的分布、長度及覆蓋率 采用在2個(gè)親本間具有多態(tài)性的SSR引物對鄭58×墨西哥類玉米回交群體進(jìn)行篩選，從BC1F1開始利用SSR分子標(biāo)記跟蹤檢測，對第10染色體上的供體導(dǎo)入片段進(jìn)行背景選擇，構(gòu)建回交群體。利用在2個(gè)親本間具有多態(tài)性的35對SSR引物對BC7F1群體進(jìn)行篩選，共獲得72份不重復(fù)的玉米第10染色體墨西哥類玉米導(dǎo)入系，其中單片段代換系材料29份，代換片段長度在4.45～100.35 cM，總長度為1 101.80 cM，平均長度38.00 cM，對第10染色體的覆蓋率為79.16%。最短的單片段為umc1115，其長度為4.45 cM，位于第10染色體293.40～297.85 cM；最長單片段為umc2122-umc1993-umc1196a-bnlg1839-umc2351-umc1877，其長度為 100.35 cM，位于第10染色體389.60～489.95 cM。大部分單片段代換系的長度在0～50 cM，長度較小的單片段數(shù)量居多，大于50 cM的單片段有6個(gè)。單片段代換系材料的詳細(xì)資料見表1，其在染色體上的位置見圖4。在BC7F1群體中所篩選的單片段在第10染色體上的分布區(qū)域?yàn)?.01～125.65 cM，172.85～322.00 cM，389.60～550.90 cM；未覆蓋到的區(qū)域主要在125.65～172.85 cM和322.00～389.60 cM。未覆蓋到的原因可能是在回交過程中來源于墨西哥類玉米的染色體單片段聚合在一起成為多片段沒有分離，也可能是由于種植的群體過小而沒有選擇到該區(qū)域的單片段。

表1 從BC7F1群體獲得的單片段代換系Tab.1 The SSSLs obtained from BC7F1 population cM

2.2.2 BC8F1群體中單片段在第10染色體上的分布、長度及覆蓋率 采用在2個(gè)親本間具有多態(tài)性的40對SSR引物對BC8F1回交群體進(jìn)行篩選，共獲得117個(gè)不重復(fù)的玉米第10染色體墨西哥類玉米導(dǎo)入系，其中單片段代換系材料有41份，代換片段長度在1.15～125.64 cM，總長度為1 884.74 cM，平均長度為45.97 cM，對玉米第10染色體的覆蓋率為89.65%，覆蓋區(qū)域?yàn)?.01～26.48 cM，180.47～300.70 cM，360.83～538.01 cM；未覆蓋到的區(qū)域主要在26.48～180.47 cM，300.70～360.83 cM，538.01～550.90 cM。最短的片段為umc1873，其長度為1.15 cM，位于第10染色體246.13～247.28 cM；最長的片段為umc2399-phi118-umc1291-umc1319-bnlg1451-phi301654-umc1432，其長度為125.64 cM，位于第10染色體0.01～125.65 cM。在所有單片段中，大多數(shù)的單片段長度在0～50 cM，大于50 cM的單片段有15個(gè)。單片段代換系的詳細(xì)資料見表2，其在染色體上的位置如圖5所示。

圖4 從BC7F1群體中獲得的單片段代換系在第10染色體上的分布Fig.4 The distribution of the SSSLs obtained from BC7F1 population on the tenth chromosome

表2(續(xù))

圖5 從BC8F1群體中獲得的單片段代換系在第10染色體上的分布Fig.5 The distribution of the SSSLs obtained from BC8F1 population on the tenth chromosome

2.2.3 BC9F1群體中單片段在第10染色體上的分布、長度及覆蓋率 采用在2個(gè)親本間具有多態(tài)性的45對SSR引物對BC9F1群體進(jìn)行篩選，共獲得69個(gè)不重復(fù)的玉米第10染色體墨西哥類玉米染色體代換系，其中單片段代換系材料有37份，代換片段長度在0.20～81.35 cM，總長度為944.15 cM，平均長度25.52 cM，對玉米第10染色體的覆蓋率為70.38%。最長的片段為bnlg1360-umc1877-umc2507-umc2021-umc1038-nlg1185，其長度為81.35 cM，位于第10染色體469.55～550.90 cM，最短的片段為umc1739，其長度為0.20 cM，位于第10染色體227.95～228.15 cM。在所有單片段中，大于50 cM的單片段有3個(gè)，大多數(shù)單片段長度介于0～50 cM。覆蓋區(qū)域?yàn)?.01～26.48 cM，71.85～125.65 cM，180.47～297.85 cM和360.83～550.90 cM；未覆蓋到的區(qū)域主要在26.48～71.85 cM，125.65～180.47 cM和297.85～360.83 cM。未覆蓋到的原因可能是在回交過程中幾個(gè)染色體單片段重疊在一起沒有分離，也可能是沒有選擇到包含該區(qū)域單片段的單株，后續(xù)檢測沒有明顯的條帶顯示。單片段代換系的詳細(xì)明細(xì)見表3，其在染色體上的位置分布見圖6。

2.3 BC9F1群體中含有穗長QTL代換片段的篩選

通過t測驗(yàn)比較代換系單株與受體親本鄭58之間穗長的差異，統(tǒng)計(jì)測驗(yàn)時(shí)將含有某個(gè)SSR標(biāo)記的代換系單株合并為一個(gè)群體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以10株鄭58單株作為一個(gè)對照群體統(tǒng)計(jì)穗長觀測值。當(dāng)P≤0.01時(shí)，染色體片段代換系與鄭58之間差異顯著，表明含有某個(gè)標(biāo)記的代換片段上存在穗長QTL。

試驗(yàn)結(jié)果表明，含有umc2528、phi054和bnlg1360標(biāo)記的片段代換系與鄭58之間穗長存在極顯著差異，含umc1877標(biāo)記的片段代換系與鄭58之間穗長存在顯著性差異，含umc2180標(biāo)記的片段代換系與鄭58之間穗長差異不顯著，共計(jì)篩選到5個(gè)穗長QTL代換片段。含umc2528片段的代換系平均穗長比鄭58短2.00 cm，表現(xiàn)為負(fù)向超親優(yōu)勢；含phi054片段的代換系平均穗長比鄭58短1.92 cm，表現(xiàn)為負(fù)向超親優(yōu)勢；含bnlg1360片段的代換系平均穗長比鄭58短1.89 cm，表現(xiàn)為負(fù)向超親優(yōu)勢；含umc1877標(biāo)記的代換系平均穗長比鄭58短1.58 cm，表現(xiàn)為負(fù)向超親優(yōu)勢。經(jīng)t測驗(yàn)比較分析，穗長QTL片段代換系與受體親本鄭58穗長差異性統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4所示。由試驗(yàn)結(jié)果可知，篩選到的4個(gè)穗長QTL代換系相比受體親本均表現(xiàn)為負(fù)向超親優(yōu)勢(表4-8)。

由于BC9F1群體種植的單株數(shù)量有限，獲得的單片段代換系數(shù)量不足，故在進(jìn)行穗長QTL篩選時(shí)選取了含有該標(biāo)記片段的所有單株合并為一個(gè)群體，進(jìn)行穗長觀測值統(tǒng)計(jì)。與鄭58之間穗長存在顯著性差異含有穗長QTL代換片段的株系如表5-8所示。

表3 從BC9F1群體獲得的單片段代換系Tab.3 The SSSLs obtained from BC9F1 population cM

圖6 從BC9F1群體中獲得的單片段代換系在第10染色體上的分布Fig.6 The distribution of the SSSLs obtained from BC9F1 population on the tenth chromosome

名稱Name平均穗長/cmTheaveragespikelength顯著性Significance鄭58Zheng5814．50±0．21umc252812．50±1．54??umc218015．36±0．87nsphi05412．58±1．22??bnlg136012．61±1．58??umc187712．92±1．32?

注：*表示P≤0.05;**表示P≤0.01;ns表示差異不顯著。

Note：*indicatesP≤0.05;** indicatesP≤0.01;ns indicates no significant difference.

3 討論與結(jié)論

單片段代換系是一種利用雜交、回交和分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合構(gòu)建的永久性作圖群體。單片段代換系由于遺傳背景單一，可用于檢測微效QTL，為QTL定位及基因克隆打下基礎(chǔ)。通過多代回交重建受體背景，以保持代換染色體不發(fā)生變化[33]。回交世代越多，受體基因純合率越高，一般回交次數(shù)達(dá)到5代后受體基因純合率可達(dá)75%，回交8代后能達(dá)到96.50%，可獲得大量染色體代換系材料[34]。本研究以BC7F1、BC8F1、BC9F1三代回交群體為材料，連續(xù)進(jìn)行SSR標(biāo)記輔助選擇構(gòu)建染色體片段導(dǎo)入系，檢測到大量單片段代換系，與前人研究結(jié)果相同[35-36]。此外，由于回交群體種植數(shù)量的限制，可能引起部分單片段代換系沒有被檢測到。

目前已構(gòu)建染色體導(dǎo)入系群體的作物有番茄、水稻、玉米、油菜等，20世紀(jì)90年代就開始了水稻染色體導(dǎo)入系群體的構(gòu)建[37-41]。在玉米單片段代換系構(gòu)建的研究中，彭倩等[42]以自交系lx9801為受體，昌7-2為供體，用回交和SSR 分子標(biāo)記相結(jié)合的方法構(gòu)建了184個(gè)單片段代換系，代換片段總長為1 683.33 cM，平均長度9.25 cM，覆蓋玉米基因組的35.50%。袁亮等[33]利用SSR分子標(biāo)記跟蹤檢測BC4、BC4F1、BC4F2和BC4F3供體染色體片段，獲得74個(gè)以lx9801 為遺傳背景的玉米單片段代換系，片段平均長度為33.39 cM，導(dǎo)入片段總長為2 470.53 cM，染色體覆蓋率為29%。張書紅[17]以玉米自交系綜3為供體，87-1為受體，利用137 個(gè)SSR 分子標(biāo)記，獲得84 個(gè)單片段代換系，供體片段總長度為2 056.45 cM，平均長度為24.48 cM，覆蓋率為32.80%。有學(xué)者以87-1為受體親本，綜3為供體親本，構(gòu)建了大量純合的單片段代換系[43-44]。也有研究人員通過構(gòu)建玉米單片段代換系，檢測出玉米開花期相關(guān)性狀的QTL[45]。本研究從BC7F1、BC8F1、BC9F13個(gè)群體中共獲得107個(gè)單片段代換系，片段的平均長度分別為38.00，45.97，25.52 cM，總長度為944.15～1 884.74 cM，對第10染色體覆蓋率為70.38%～89.65%。長度小的單片段是研究QTL的優(yōu)良材料，與前人研究結(jié)果相比較，本研究所獲得的單片段長度略偏大，在染色體上覆蓋率較高，其原因可能是所用的引物數(shù)量偏少，引物在第10染色體上分布密度偏低。同時(shí)，本研究所獲單片段代換系均來自第10染色體，在片段數(shù)量上相比整個(gè)染色體組偏少。本研究只針對第10染色體進(jìn)行單片段代換系的構(gòu)建，為今后玉米第10染色體上相關(guān)性狀QTL的精細(xì)定位奠定了基礎(chǔ)。

表5 含umc2528穗長QTL片段的代換系Tab.5 Segment substitution lines of spike length QTL containing umc2528

表5(續(xù))

表6 含phi054穗長QTL片段的代換系Tab.6 Segment substitution lines of spike length QTL containing phi054

表7 含bnlg1360穗長QTL片段的代換系Tab.7 Segment substitution lines of spike length QTL containing bnlg1360

表8 含umc1877穗長QTL片段的代換系Tab.8 Segment substitution lines of spike length QTL containing umc1877

玉米穗長性狀是玉米產(chǎn)量的重要構(gòu)成因子，一直是玉米研究的重要目標(biāo)性狀。為鑒定玉米穗長性狀的QTL并對其進(jìn)行克隆，學(xué)者們利用不同的分離群體對穗長、穗行數(shù)等穗部性狀進(jìn)行了大量研究，定位了部分主效QTL[46-48]。通過單片段代換系群體與受體親本表型指標(biāo)的對比，可以篩選出含有優(yōu)良QTL性狀的代換系材料。王幫太等[44]利用SSSLs材料對玉米穗長進(jìn)行了表型鑒定，篩選到20個(gè)穗長QTL，超親優(yōu)勢在-12.10%～19.18%。李衛(wèi)華等[8]利用優(yōu)良玉米自交系構(gòu)建單片段代換系群體，通過鑒定篩選到9個(gè)穗長性狀QTL。本研究從BC9F1群體中初步定位了玉米第10染色體上4個(gè)穗長的QTL，其中含umc2528、phi054、bnlg1360標(biāo)記片段的代換系與受體親本鄭58之間在穗長上存在極顯著差異，umc1877與鄭58之間存在顯著差異。4個(gè)穗長QTL均表現(xiàn)為負(fù)向超親優(yōu)勢，相對于前人的研究，本試驗(yàn)獲得的穗長QTL數(shù)量偏少，且沒有篩選到正向超親優(yōu)勢的QTL，其原因可能是BC9F1群體種植數(shù)量有限，獲得的SSSLs數(shù)量較少。

回交的主要目的是恢復(fù)受體親本的遺傳背景，利用回交和分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合的方法，可以快速建立染色體單片段代換系[49-50]。這個(gè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可大大縮短回交轉(zhuǎn)育世代周期，最大限度地減少目標(biāo)基因的遺傳累贅，有效地清除非輪回親本的遺傳背景。在本研究中，使用栽培玉米作為輪回親本導(dǎo)入了玉米野生近緣種的優(yōu)良基因。由于野生近緣種質(zhì)的豐富遺傳變異性，傳統(tǒng)作圖群體如F2、DH、RIL、BC等，在后代變異中存在大量的基因分離與交換，后代的遺傳背景更復(fù)雜于普通栽培玉米種內(nèi)雜交或自交，因而回交是首選的育種方法之一。本研究利用連續(xù)多代回交群體進(jìn)行單片段導(dǎo)入系的構(gòu)建，隨著回交代數(shù)的增加，獲得的SSSLs在第10染色體基因組上的覆蓋率逐漸增加，這對于進(jìn)行更多目標(biāo)性狀QTL的鑒定和精細(xì)定位，具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。

構(gòu)建了以玉米自交系鄭58為遺傳背景的墨西哥類玉米導(dǎo)入系群體，獲得了107份單片段代換系材料。在第10染色體上篩選到4個(gè)具有負(fù)超親優(yōu)勢的穗長QTL代換片段，初步定位于umc2528、phi054、bnlg1360和umc1877標(biāo)記附近。今后，可通過增加染色體上引物密度，擴(kuò)大世代群體種植數(shù)量，篩選出含有更多優(yōu)良性狀QTL的單片段代換系。

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