朱海霞 - 張小芳 - 高 洋 丁婭娜 -

(漯河食品職業(yè)學院，河南 漯河 462000)

蘿卜籽又稱萊菔子，是十字花科植物蘿卜成熟種子的稱法[1]。蘿卜籽粕是生產(chǎn)蘿卜籽油后所余的副產(chǎn)物。近些年的研究表明，蘿卜籽中含有大量的硫苷、黃酮、甾醇等活性物質(zhì)[2]，這些物質(zhì)的存在與蘿卜籽具有很好的抗菌活性、解毒、降壓、預防心血管疾病的作用有很大關系[3-5]。目前關于蘿卜籽的研究多集中在油脂、多糖、蛋白等[6-8]，關于其黃酮的研究尚無相關報道。

關于黃酮的提取方法有很多[9-11]，熱水提取法工藝成本低、對環(huán)境及人類無毒害，可應用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[12-13]，而超聲波輔助在分離提取黃酮類成分中已得到廣泛應用[14-15]。本試驗擬采用超聲波輔助熱水提取法對蘿卜籽粕中的黃酮類化合物進行提取，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗優(yōu)化提取工藝，并對所提取的產(chǎn)物進行脫蛋白、脫多糖純化，以期為蘿卜籽中黃酮的提取及蘿卜籽粕的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

蘿卜籽粕：武漢市蔬菜科學研究所生產(chǎn)蘿卜籽油后所剩余的蘿卜籽餅粕，經(jīng)粉碎后備用；

98%蘆丁標準品：博美生物科技有限責任公司；

氫氧化鈉、無水乙醇：分析純，西隴化工股份有限公司；

鹽酸、九水硝酸鋁、亞硝酸鈉：分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；

無水三氯化鐵：分析純，上海展云化工有限公司；

氯仿：分析純，魯西化工集團股份有限公司；

蒽酮：分析純，鄭州冠輝化工產(chǎn)品有限公司；

濃硫酸：分析純，山東淄博華贊化工有限公司；

無水葡萄糖：分析純，河南云創(chuàng)化工產(chǎn)品有限公司。

1.2 主要儀器

臺式高速冷凍離心機：TGL-20bR型，上海安亭科學儀器廠；

紫外分光光度計：752N型，上海精科儀電器廠；

旋轉蒸發(fā)儀：RE5203型，上海滬析實業(yè)有限公司；

真空干燥箱：DF-6020型，上海一恒科學儀器有限公司；

多功能超聲波提取儀：Biosafer-4000Q型，賽飛(中國)有限公司；

電子天平：FA1604型，上海天平儀器廠；

數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋：HH600型，力辰科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃酮的測定

(1) 蘆丁標準曲線的繪制：參照文獻[9]，蘆丁曲線濃度梯度分別為：0.06，0.12，0.18，0.24，0.30，0.36，0.42，0.48，0.54，0.60 mg/mL。

(2) 提取液中黃酮含量的測定：按照亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法提取完成后，取200 μL的提取液在510 nm下測定吸光度值，得回歸方程y=3.875 3x+0.273 9，R2=0.999 6。

1.3.2 多糖的測定 按照硫酸-蒽酮法進行測定，以多糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標做標準曲線。得回歸方程y=10.079x+0.009 5，R2=0.999 0。

1.3.3 蛋白質(zhì)的測定 采用考馬斯亮藍G-250染色法[16]。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標做標準曲線，得回歸方程y=10.086x+0.007，R2=0.999 2。

1.3.4 超聲波輔助提取蘿卜籽粕中黃酮

(1) 超聲功率：固定超聲時間10 min、料液比1∶20 (g/mL)，考察超聲功率(100，200，300，500，700 W)對蘿卜籽粕中黃酮提取效果的影響。

(2) 超聲時間：固定超聲功率500 W、料液比1∶20 (g/mL)，考察超聲時間(5，10，15，20，25 min)對蘿卜籽粕中黃酮提取效果的影響。

(3) 料液比：固定超聲功率500 W、超聲時間10 min，考察料液比[1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 (g/mL)]對蘿卜籽粕中黃酮提取效果的影響。

(4) 正交試驗：以超聲功率、超聲時間、料液比為因素，通過正交試驗篩選出最佳的提取工藝。

1.3.5 蘿卜籽粕中黃酮脫多糖試驗

(1) 乙醇溶液濃度：固定脫除時間4 h、黃酮和乙醇溶液的體積比1∶3，考察乙醇溶液濃度(50%，60%，70%，80%，90%)對蘿卜籽黃酮中多糖脫除效果的影響。

(2) 脫除時間：固定乙醇溶液濃度80%、黃酮和乙醇溶液的體積比1∶3，考察脫除時間(0.5，1，2，3，4，5 h)對蘿卜籽黃酮中多糖脫除效果的影響。

(3) 黃酮和乙醇溶液的體積比：固定乙醇溶液濃度80%、脫除時間4 h，考察黃酮和乙醇溶液的體積比(1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5)對蘿卜籽黃酮中多糖脫除效果的影響。

(4)正交試驗：以乙醇濃度、黃酮-乙醇體積比、脫糖時間為因素，通過正交試驗篩選出最佳的多糖去除工藝。所得的試驗結果按照式(1)進行計算。

(1)

式中：

t——總得分；

p——多糖脫除率，%；

h——黃酮損失率，%。

1.3.6 蘿卜籽粕中黃酮脫蛋白試驗

(1) 脫除時間：固定氯仿-正丁醇體積比2∶1、Sevage溶液與黃酮體積比4∶1，考察脫除時間(10，20，30，40 min)對蘿卜籽粕中黃酮脫蛋白效果的影響；

(2) 氯仿-正丁醇體積比：固定脫除時間30 min、Sevage溶液與黃酮體積比4∶1，考察氯仿-正丁醇體積比(2∶1，3∶1，4∶1，5∶1)對蘿卜籽粕中黃酮脫蛋白效果的影響；

(3) Sevage溶液與黃酮體積比：固定脫除時間30 min、氯仿-正丁醇體積比2∶1，考察Sevage溶液與黃酮體積比(2∶1，3∶1，4∶1，5∶1)對蘿卜籽粕中黃酮脫蛋白效果的影響。

(4)正交試驗：以脫除時間、氯仿-正丁醇體積比、Sevage溶液與黃酮體積比為因素，通過正交試驗篩選出脫除蛋白效果最佳的工藝條件。

2 結果與分析

2.1 蘿卜籽粕中總黃酮含量

用精密電子天平稱取蘿卜籽粕1 g，用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測得黃酮含量分別為：2.02%，2.11%，2.04%，黃酮總含量的平均值為2.06%。

2.2 超聲波浸提對蘿卜籽粕中黃酮提取的影響

2.2.1 超聲波功率 由圖1可知，隨超聲波功率的增加，蘿卜籽粕中黃酮浸出率先增加后減少，在超聲波功率500 W時浸出率較高?？赡苁怯捎诔暡üβ试礁?，固液傳波速度越好，物料升溫也越好，且對物料細胞破壞效果越好，有助于黃酮提出，當超聲波功率增加到一定程度時，高超聲波功率可能分解了蘿卜籽粕中黃酮，使浸出率減少。綜合分析，選擇超聲波功率為500 W。

圖1 超聲波功率對黃酮浸出率的影響Figure 1 Effect of ultrasonic power on extraction rate of flavonoids

2.2.2 超聲波浸提時間 由圖2可知，隨超聲波處理時間的延長，蘿卜籽粕中黃酮浸出比例逐漸升高，10 min后，浸出率降低。可能是超聲波處理過久，溫度過高，黃酮結構遭到破壞，所以黃酮的浸出率降低。綜合分析，選擇超聲波浸提時間為10 min。

2.2.3 浸提料液比 由圖3可知,隨溶劑的增加，蘿卜籽粕中黃酮浸出率先升后降，當料液比為1∶20 (g/mL)時，黃酮浸出率最高。因此，選擇料液比為1∶20 (g/mL)。

圖2 超聲波時間對黃酮浸出率的影響Figure 2 Effect of ultrasonic time on extraction rate of flavonoids

圖3 料液比對黃酮浸出率的影響Figure 3 Effect of feed liquid ratio on the extraction rate of flavonoids

2.2.4 正交試驗 以超聲功率、超聲時間、料液比為因素，采用三因素三水平L9(33)的正交試驗。正交試驗因素水平及結果見表1、2。

由表2可知，各因素對蘿卜籽黃酮的浸出率影響順序為超聲功率>超聲時間>料液比，最佳參數(shù)組合為A2B2C1，即超聲波功率500 W，超聲波時間10 min，料液比1∶15 (g/mL)，該條件下測得蘿卜籽黃酮的浸出率為1.90%，優(yōu)于正交組合中的試驗結果，說明此結果可作為優(yōu)化后的提取條件。

通過上述試驗進行比較，發(fā)現(xiàn)在溫度，料液比相似的狀況下，超聲波輔助提純速度要遠遠快于常規(guī)熱水提純，因此選用超聲波輔助提純能夠極好地提高提純效果。

2.3 蘿卜籽粕中黃酮溶液脫多糖結果分析

通過單因素試驗，得出用醇沉法除多糖最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度為85%，黃酮提取液-乙醇體積比為1∶3.5，提取時間為4 h，根據(jù)此三因素試驗結果進行三因素三水平正交試驗，因素水平及結果見表3、4。

表1 超聲波提取蘿卜籽粕中黃酮試驗因素水平表Table 1 Ultrasonic extraction of flavonoids of semen Raphani orthogonal table

表2 超聲波提取蘿卜籽粕中黃酮正交試驗結果Table 2 Ultrasonic extraction of flavonoids of semen Raphani orthogonal table

由表4可知，脫除時間對黃酮提取液脫多糖影響最大，其次是乙醇濃度，黃酮提取液-乙醇體積影響較小。蘿卜籽黃酮提取液最佳的脫多糖條件是A3B3C2，即乙醇濃度85%，黃酮提取液-乙醇體積比1∶3.5，提取時間4 h，能脫去73.2% 的多糖，此時的黃酮損失率在34.86%。在正交試驗表中脫除率較高，而黃酮的損失率較低，說明此條件是脫除蘿卜籽粕中黃酮中多糖的適宜條件。

表3 蘿卜籽粕中黃酮多糖脫除試驗因素水平表Table 3 Flavonoids polysaccharides in semen Raphani removal orthogonal table

表4蘿卜籽粕中黃酮中多糖脫除正交試驗結果

Table 5 The removal of polysaccharides in semen Raphani flavone orthogonal experimental results

試驗數(shù)ABC多糖脫除率/%黃酮損失率/%總得分111163.5338.5293.25212269.5233.50101.26313365.0434.0698.46421268.3033.27100.88522369.3236.3298.34623166.0731.90101.14731365.1033.0099.55832164.3232.05100.11933273.2034.86101.74K197.6697.8998.16K2100.1299.90101.29K3100.47100.4598.78R2.812.553.13

2.4 蘿卜籽粕中黃酮脫蛋白結果分析

通過單因素試驗，得出Sevage法脫除蛋白各因素最佳參數(shù)為：沉淀時間20 min，氯仿-正丁醇體積比為3∶1；Sevage溶液-黃酮體積比3∶1，根據(jù)此三因素試驗結果進行三因素三水平正交試驗。正交表試驗因素水平及結果見表5、6。

表5 蘿卜籽粕中黃酮蛋白質(zhì)脫除試驗因素水平表Table 5 The orthogonal table of protein removal in flavonoids of semen Raphani

表6蘿卜籽粕中黃酮蛋白質(zhì)脫除正交試驗結果

Table 6 The experimental results of orthogonal protein removal in flavonoids of semen Raphani

試驗數(shù)ABC蛋白質(zhì)脫除率/%黃酮損失率/%總得分111165.1223.11109.45212268.0524.14109.89313367.0823.86109.68421270.2124.73110.38522371.3224.12111.54623170.0620.06114.97731375.3225.04112.62832169.5328.08106.69933273.2024.67111.93K1109.67110.82110.37K2112.30109.37110.73K3110.41112.19111.28R2.622.820.91

由表6可知，氯仿和正丁醇的體積比對結果影響最大；其次是脫蛋白時間，影響最小的是Sevage-黃酮體積比。蘿卜籽粕中黃酮提取液最佳的脫蛋白條件是A2B3C1，即沉淀時間20 min，氯仿-正丁醇體積比3∶1；Sevage-黃酮體積比2.5∶1，此時蛋白質(zhì)脫除率為70.06%，黃酮損失率為20.06%。在正交試驗表中損失率最低，說明此條件為Sevage法脫除蛋白的最佳條件。

3 結論

本試驗通過超聲波輔助熱水法提取蘿卜籽粕中黃酮，并研究醇沉法、Sevage法分離純化效果。結果表明，在超聲波功率500 W、超聲波時間10 min、料液比1∶15 (g/mL)的條件下提取黃酮，于乙醇濃度85%、黃酮提取液-乙醇體積比1∶3.5、提取時間4 h的條件下脫除多糖，再于沉淀時間20 min、氯仿-正丁醇體積比3∶1、Sevage-黃酮體積比2.5∶1的條件下脫蛋白時，蘿卜籽粕黃酮的分離純化效果最佳。后續(xù)可對不同的提取方式及純化方式進行比較研究，而且有必要深挖黃酮類化合物的藥學作用及其結構。

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