樊菲菲，袁位高，李婷婷，吳初平，張 覺，焦?jié)崫?/p>

（1. 浙江農(nóng)林大學 林業(yè)與生物技術學院，浙江 杭州 311300；2. 浙江省林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310023）

水分是維持植物正常生長的必要條件，但土壤中水分過多會阻礙植物的呼吸，造成植物組織缺氧，對植物的形態(tài)特性和生長發(fā)育會產(chǎn)生顯著的負影響[1]，如葉綠素降解加劇[2]，保護酶系統(tǒng)受損[3]，可溶性糖和可溶性蛋白含量發(fā)生變化[4]，加劇植物葉片中細胞膜脂過氧化程度，即丙二醛含量的積累[5]。此外，土壤中的水分脅迫對一些瀕危稀有物種的影響更大，如沙冬青Ammopiptanthus mongolicus[6]，杜鵑紅山茶Camellia azaleaWei[7]等，故而，水分脅迫可能是影響物種滅亡的主要因子之一。

櫸樹Zelkova serrata屬榆科Ulmaceae櫸樹屬Zelkova落葉大喬木，國家二級重點保護野生植物，主要分布在我國秦嶺及淮河以南，長江中下游至華南、西南各省區(qū)[8]，浙江是櫸樹主產(chǎn)區(qū)之一。櫸樹具有較高的經(jīng)濟和觀賞價值[9]，是浙江省優(yōu)良的平原、河道綠化樹種之一。目前，國內(nèi)關于櫸樹耐水淹能力的研究較少，教忠意等[10]對櫸樹受澇后葉形、葉色、脫落的葉片數(shù)、皮孔和不定根產(chǎn)生時間等形態(tài)特征進行了觀察，找出樹種受澇時間長短的臨界值和受淹后的形態(tài)變化，以此來判斷櫸樹耐水淹能力的強弱。本試驗通過人工模擬水淹條件，測定不同水淹梯度下櫸樹幼苗的葉片總?cè)~綠素含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、丙二醛（MDA）含量、可溶性糖和可溶性蛋白含量，旨在探索水淹脅迫對櫸樹的傷害機制以及櫸樹對水淹環(huán)境的適應機制，為提高櫸樹栽培和造林工作中水分管理技術和浙江省河道生態(tài)建設中樹種的選擇提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

實驗地點設在浙江省林業(yè)科學研究院溫室大棚，地處 118°21′ ～ 120°30′ E，29°11′ ～ 30°33′ N。該區(qū)屬典型的亞熱帶季風性濕潤氣候，年平均氣溫15.3 ～ 18.5℃，最低月均氣溫2.7 ～ 7.9℃，最高月平均氣溫27.0 ～ 29.5℃，≥10℃年積溫4 800 ～ 5 800℃，無霜期225 ～ 280 d；年降水量1 000 ～ 2 000 mm，以春雨、梅雨、臺風雨為主，7 ～ 8 月有伏旱。

1.2 試驗設計

實驗材料為2015年于浙江省建德市欣林中心播種培育的2年生營養(yǎng)袋容器苗（營養(yǎng)袋內(nèi)徑和高均為15 cm），選擇生長狀況相近的苗木作為試驗對象，平均苗高和地徑分別為（45.29±3.69）cm和（0.82±0.66）cm。設置4個處理，分別為正常、輕度脅迫、中度脅迫和重度脅迫，即對照（CK）、根淹（RF）、半淹（SF）和近全淹（AF）。每個處理重復5次，即5株。具體處理情況：幼苗澆透后的次日，將其（對照除外）放入81 cm×70 cm×65 cm的塑料箱中進行水淹處理。用泰州市正大科教儀器設備廠生產(chǎn)的ZD-1608土壤水分專用檢測儀保持CK盆內(nèi)土壤含水量在75% ～ 80%；RF，土壤表面滲水，水位不超過1 cm；SF，植株地上部分一半水淹；AF，植株頂端露出水面約3 cm。之后每天保持水位，每隔3 d左右進行換水，保證水體干凈。將櫸樹的采樣間隔期定為7 d，當水淹致使植株葉片萎蔫壞死約50%時，停止實驗。脅迫從2016年8月1日開始，9月4日結(jié)束，水淹共35 d。實驗結(jié)束時，即于9月5日將植物從塑料箱中取出進行排澇，盆內(nèi)土壤含水量達到CK水平處理之后繼續(xù)保持，14 d后（R14 d），即于9月18日測定植株各項生理指標。各水淹處理和排澇恢復實驗的采樣均在早上進行，取每株苗木上中下部位生長良好、大小均一的成熟葉片3 ～ 4片，用自來水清洗葉片表面污物，再用蒸餾水沖洗2 ～ 3次后，擦凈表面水分，混合采集葉片后進行生理指標測定，重復3次。

1.3 測定內(nèi)容與方法

于水淹脅迫開始前和排澇14 d后分別測定各處理下植物的苗高和地徑。用卷尺測量苗高，精確到0.1 cm；用游標卡尺在高于土面1 cm處測定地徑，精確到0.01 mm。定株觀測，每處理5次重復。

相對增長量＝排澇后測量值-脅迫前測量值

相對增長速率＝（相對增長量/脅迫前測量值）×100%

測定各項生理指標時，均取0.1 g樣品?？?cè)~綠素含量的測定采用直接浸提法測定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑還原法測定；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定[11]；過氧化物酶（POD）活性參考汪南陽等采用愈創(chuàng)木酚法測定[12]。

可溶性糖含量（μmol·g-1）＝可溶性糖濃度×V/(FW×103)（V：提取液總體積，mL；FW：樣品鮮質(zhì)量，g）

可溶性糖濃度（μmol·g-1）=11.71A450[13]，其中A450測定方法同MDA的測定。吸光值測定均采用UV-4802S雙光束紫外可見分光光度計進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得實驗數(shù)據(jù)用Excel 2016進行整理，用Origin Pro 8.5軟件作圖，用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析以及相關性分析，并用Duncan法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 水淹脅迫對櫸樹苗高和地徑的影響

由表 1可知，水淹脅迫及恢復后，隨著水淹脅迫程度的增加，櫸樹幼苗的生長受到了顯著的抑制作用。3個水淹處理下的苗高相對增長量均顯著低于CK（P<0.05），RF，SF，AF分別比CK下降了63.38%，70.0%，84.93%。櫸樹幼苗地徑相對增長量的變化趨勢同苗高相對增長量的變化趨勢相比，下降幅度較小。三個水淹處理下的地徑相對增長量，從輕度到重度分別比CK下降了13.73%，37.25%，53.92%?？梢园l(fā)現(xiàn)AF組各指標的下降幅度最大，且處于4組處理的最低水平。

表1 不同水淹處理對櫸樹苗高、地徑生長的影響Table 1 Effect of different treatments of water logging on height and ground diameter growth of Z. serrata seedlings

2.2 水淹脅迫對櫸樹葉片葉綠素含量的影響

由圖 1可見，CK處理櫸樹幼苗葉片葉綠素含量的變化隨著時間的延長呈先升后降的趨勢，生長前、中期葉綠素含量較高，隨后明顯下降。RF組沒有改變?nèi)~綠素含量的總體變化趨勢，但明顯降低了葉綠素的含量，在脅迫時間超過7 d之后，顯著低于CK（P<0.05）。SF組葉綠素含量的變化情況同 RF組相似，但其葉綠素含量一直維持在低于CK卻高于RF的水平。AF組的櫸樹葉片葉綠素含量明顯低于 CK，其葉綠素含量的變化趨勢受到的影響最顯著。R14 d后，各處理下櫸樹葉片的葉綠素含量分別比脅迫0 d時下降了20.50%，38.54%，38.66%，59.28%。此時，3組水淹脅迫處理下的葉綠素含量顯著低于CK（P<0.05），其中，AF處理的葉綠素含量處于4組脅迫處理的最低水平。

圖1 水淹脅迫對櫸樹葉片葉綠素含量的影響Figure 1 Effect of water logging on chlorophyll content in leaves of Z. serrata seedlings

2.3 水淹脅迫對櫸樹葉片2種主要抗氧化酶活性的影響

隨著脅迫時間的延長，不同處理下櫸樹幼苗葉片SOD活性的變化趨勢也不同（圖2A）。CK組的SOD活性在28 d前隨幼苗生長而逐漸下降，在28 d時下降至最小值，比0 d降低了41.32%，而后開始回升，至35 d時酶活性接近0 d時的水平。隨著脅迫程度的加深，3組水淹處理下SOD活性的升降變化幅度加大，均在生長前期不斷下降，又在21 d時急速上升，與CK相比，回升速度加快；之后3組水淹處理內(nèi)SOD酶活性的變化趨勢各有不同，脅迫至35 d時，RF和AF組的酶活性分別比0 d升高了32.64%，39.27%，而SF組的酶活性僅升高9.76%?？傮w上看，3組水淹處理下櫸樹葉片SOD活性在脅迫中后期一直保持著顯著高于CK組的水平（P<0.05），其中，AF組的酶活性處于處理間最高水平。至R14 d時，各處理下櫸樹葉片SOD活性與0 d時相比升降幅度不大，其中，AF組的酶活性上升，其他則下降。此時，只有AF組的酶活性顯著高于其他3組處理水平（P<0.05）。

圖2 水淹脅迫對櫸樹葉片抗氧化酶活性的影響Figure 2 Effect of water logging on antioxidant enzyme activities in leaves of Z. serrata seedlings

由圖2B可見，隨著脅迫時間的延長，各水淹處理下櫸樹幼苗葉片POD活性的變化總體上均呈先升后降的趨勢，且均在脅迫至28 d時達到組內(nèi)最大值，依次比0 d提高了0.59，1.17，1.14，1.34倍。但水淹脅迫后對3組水淹處理下POD酶活性的升降幅度產(chǎn)生了不同影響，RF和SF組的酶活性在28 d之前一直處于較低的水平，在28 d時酶活性急速上升并顯著超過CK組（P<0.05）；AF組的POD酶活性在脅迫時間超過7 d之后，一直維持著明顯高于CK組的水平。至35 d時，4組處理下葉片POD的酶活性開始大幅度下降，但依舊高于0 d，分別升高了15.01%，39.25%，50.03%，79.67%，AF組的酶活性顯著高于其他組水平（P<0.05）。至R14 d時，CK和RF組的酶活性分別比0 d下降了31.05%，24.50%，而其他處理下依舊保持較高的酶活性水平。此時，AF組的POD酶活性處于4組處理間的最高水平。

2.4 水淹脅迫對櫸樹葉片丙二醛含量的影響

由圖3可見，隨著脅迫時間的延長，各處理下櫸樹幼苗葉片 MDA含量均呈先升后降的變化趨勢，但 CK組的MDA含量在14 d時已經(jīng)上升到組內(nèi)最大值，而3組水淹處理下的MDA含量均在21 d時達到最高水平，且顯著高于CK（P<0.05），分別比0 d提高了1.30，1.70，1.57倍；至35 d時，4組處理下的MDA含量依次比0 d升高了26.0%，66.60%，73.02%，79.36%。RF組MDA含量的升降幅度小于CK組；SF組MDA含量的水平整體上高于RF；AF組的MDA含量在整個水淹期內(nèi)一直保持著較高水平，在脅迫中后期顯著高于其他處理（P<0.05）。至R14d時，各水淹處理下櫸樹葉片MDA含量與0 d相比分別升高了16.23%，17.20%，19.05%，17.01%。

圖3 水淹脅迫對櫸樹葉片MDA含量的影響Figure 3 Effect of water logging on MDA content in leaves of Z. serrata seedlings

2.5 水淹脅迫對櫸樹葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

各脅迫處理下櫸樹葉片可溶性糖含量隨著時間的延長變化波動較大（圖4A）。CK組內(nèi)葉片可溶性糖含量呈不斷大幅度下降趨勢，在35 d時比0 d時下降了55.0%。3個水淹組內(nèi)可溶性糖的含量總體上呈波浪性變化，在脅迫前期含量不斷下降，隨后含量上升，脅迫至35 d時又下降，分別比0 d下降了41.18%，12.70%，17.32%。RF和SF組內(nèi)可溶性糖含量在脅迫中后期顯著超過CK（P<0.05）；AF組內(nèi)含量則在整個水淹過程中一直處于4組處理的最高水平。至R14 d時，只有CK組內(nèi)的可溶性糖含量急速上升，比0 d時高了36.17%，而其他3組的可溶性糖含量均顯著低于CK組（P<0.05），且基本恢復至0 d時的水平范圍內(nèi)。

由圖4B可見，各處理下可溶性蛋白含量的變化幅度也很大，整體上均幼苗生長前期呈不同程度下降，隨后含量上升。CK組的可溶性蛋白含量在35 d時上升到組內(nèi)最大值，比0 d高了14.71%，但經(jīng)過水淹后，縮短了蛋白含量達到處理內(nèi)最高水平的時間。RF和SF組、AF組的蛋白含量在28 d、21 d達到峰值，分別比0 d高了36.35%，42.18%，13.29%。RF組的蛋白含量降低或升高的幅度明顯大于其他處理；水淹前SF組內(nèi)蛋白含量水平最低，但在脅迫中后期上升速度較快，并顯著超過CK組的水平（P<0.05）；AF組的蛋白含量的下降速度較快，至35 d時顯著低于其他處理內(nèi)水平（P<0.05），比0 d下降了40.62%。至R14 d時，3組水淹處理下的可溶性蛋白含量均顯著低于CK（P<0.05），分別比0 d降低了62.22%，53.92%，67.16%。

圖4 水淹脅迫對櫸樹葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響Figure 4 Effects of flooding stress on osmotic adjusting substances in leaves of Z. serrata seedlings

2.6 水淹脅迫下櫸樹各項生理指標間的相關性

由表2可知，各項生理指標之間相關性較弱，但存在一定聯(lián)系。葉綠素總含量與POD活性呈顯著正相關，與可溶性糖含量呈顯著負相關，與可溶性蛋白含量呈極顯著正相關；SOD活性與POD活性、可溶性糖含量呈極顯著正相關，與MDA含量、可溶性蛋白含量呈顯著正相關。POD活性與可溶性蛋白含量呈顯著正相關。再結(jié)合各指標在水淹脅處理下響應的穩(wěn)定性，確定主要指標為葉綠素、酶活性和MDA。

表2 不同水淹處理下櫸樹葉片生理指標變化的相關性分析Table 2 Analysis of correlation about changes of physiological indexes of Z. serrata under different flooding treatment

3 討論與結(jié)論

在水淹環(huán)境下，長時間的供氧不足將導致植物由有氧呼吸逐漸向無氧呼吸轉(zhuǎn)變，植物生長因此受到影響[14]。植物生長受到的抑制作用一般隨脅迫程度的加深而越顯著。本實驗中，處理間的苗高和地徑相對增長量的順序均為 CK＞RF＞SF＞AF。櫸樹在水淹環(huán)境中可采取“靜默策略”[15]，即抑制地上部分生長，減少養(yǎng)分消耗，提高自身對水淹的耐受性[16]。

水淹造成厭氧或缺氧的生長環(huán)境，阻礙植物根系內(nèi)部礦物質(zhì)的運輸，造成地上部分營養(yǎng)不良，葉片發(fā)黃，葉綠素含量下降[17-18]。本實驗中，3種水淹脅迫明顯抑制了櫸樹葉片葉綠素含量的積累；排澇后，水淹組的葉綠素含量均小于脅迫前水平，CK組的葉綠素含量也有所下降，下降幅度大小順序為：AF＞SF＞RF＞CK。植物自身生長受到季節(jié)更替時的氣溫影響，導致葉片葉綠素含量有所下降。另外，隨著脅迫程度的加深，水淹植物的葉綠體膜結(jié)構(gòu)受到的損害越嚴重，加快了葉綠素的降解[19]。水淹植物的葉綠素含量受到生長條件和脅迫環(huán)境的雙重影響而下降更為顯著。

SOD和 POD是植物體內(nèi)普遍存在且活性較高的兩種活性氧清除酶，在植物受到逆境脅迫時，可抵御活性氧自由基帶來的毒害作用；MDA含量的高低可以反映細胞膜脂過氧化程度和植物逆境條件反應的強弱[20-23]。本實驗中，水淹脅迫顯著提高了酶活性和MDA含量，且排澇后重度脅迫下酶活性仍保持較高活性，MDA含量則下降接近水淹前水平。說明該脅迫未超出植物細胞的承受能力，細胞仍可以通過調(diào)節(jié)兩者之間的相互作用，清除細胞內(nèi)過多氧自由基并降低膜脂過氧化程度來提高植物的逆境適應性和存活能力[24-25]。

植物在水淹環(huán)境下可以通過調(diào)節(jié)可溶性糖和可溶性蛋白的含量來保持細胞滲透勢的平衡，以此抵抗水分脅迫帶來的傷害[18]。本實驗中，3種水淹脅迫不同程度地提升了櫸樹的可溶性糖和可溶性蛋白的含量，植物自身可通過積累大量可溶性糖和蛋白來降低細胞滲透勢，緩解水淹下脅迫對細胞膜系統(tǒng)造成的傷害[20,26]。排澇后前者含量仍能維持在水淹前的生理水平范圍內(nèi)，但后者含量顯著下降，其中重度水淹脅迫的下降幅度最大。此時脅迫已超過植物細胞的耐受極限，蛋白酶的活性迅速提高，加快了蛋白質(zhì)的水解，促使蛋白質(zhì)大量降解成可溶性糖等物質(zhì)[27-28]，以此提高櫸樹對水分脅迫的適應性。這與利容千等[29]對植物抗性指標研究所得結(jié)論一致。

綜上所述，櫸樹會通過改變生長形態(tài)和生理調(diào)節(jié)作用來應對水淹脅迫帶來的傷害，即使在重度脅迫下櫸樹仍具有較高的酶活性、膜脂過氧化程度和滲透調(diào)節(jié)能力。所有受淹植株在排澇后均能重新萌葉，表現(xiàn)出較強的耐水淹能力與自我恢復能力。這一結(jié)論為櫸樹在推進“森林浙江”、“1818平原綠化行動”、“五水共治”中晉升為優(yōu)良平原、河道綠化樹種中進一步提供了有效依據(jù)。

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