王化敏， 丁鑒鋒、2， 楊東敏， 牟政強(qiáng)， 霍忠明、2， 閆喜武、2， 包琳

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023；2.遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116023)

菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum隸屬于軟體動物門、簾蛤目、簾蛤科、蛤仔屬，是世界性養(yǎng)殖貝類，具有生長迅速、養(yǎng)殖周期短、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，是中國四大養(yǎng)殖貝類之一。菲律賓蛤仔主要棲息于內(nèi)灣、河口和沿海灘涂等生存條件經(jīng)常發(fā)生較大變化的區(qū)域，溫度、鹽度和水中溶解氧的變化能夠?qū)ζ浯x、免疫和生長等造成影響，環(huán)境脅迫所導(dǎo)致的貝類對病原的抵抗力下降是誘發(fā)貝類大規(guī)模死亡的一個重要原因[1－2]。水中氧氣的含量是影響水生動物生長發(fā)育的重要因子之一[3]。溶氧降低對貝類的生長和生存等具有重要的影響，低氧能夠引起波羅地海蛤Macoma balthica潛沙行為異常[4]；綠唇鮑 Haliotis laevigata Donovan在低氧條件下生長速度和耗氧率均顯著降低[5]；水中溶氧降低能夠?qū)е旅乐弈迪燙rassostrea virginica幼蟲附著率顯著降低，死亡率也較正常氧氣條件下有所升高[6]，附著后牡蠣幼蟲在低氧條件下攝食率降低，生長速度減慢[7]；雜色鮑Haliotis diversicolor supertexta氨基酸平衡和無氧代謝過程在溶氧含量降低時發(fā)生紊亂[8]；溝紋蛤仔Ruditapes decussatus在低氧海水中的清除率、攝食率和排泄率均降低，并導(dǎo)致其能量代謝率也隨之降低[9]；干露造成的低氧脅迫導(dǎo)致四角蛤蜊Mactra veneriformis血淋巴細(xì)胞總數(shù)、血細(xì)胞吞噬能力、溶菌酶和酚氧化酶活性等免疫指標(biāo)降低[10]；低氧條件下翡翠貽貝Perna viridis血淋巴中的血細(xì)胞數(shù)和吞噬活性也顯著低于正常溶氧組[11]；長期處于低氧環(huán)境中，菲律賓蛤仔的組織結(jié)構(gòu)異常，活力下降[12]。低氧通常是指海水中溶解氧濃度低于2 mg/L[13]。雙殼貝類對低氧的適應(yīng)可以通過提高呼吸強(qiáng)度以更有效地從水中獲取氧氣，或者通過減少體內(nèi)有氧代謝而增加無氧代謝過程以降低氧氣消耗[9]。低氧脅迫所導(dǎo)致的貝類免疫能力降低是導(dǎo)致貝類死亡的重要原因之一[10，14]。因此，了解貝類對低氧的耐受機(jī)制具有重要意義。

研究表明，不同殼色菲律賓蛤仔在耐受性、抗逆性和生長速率等方面表現(xiàn)出顯著差異，并且能穩(wěn)定遺傳給下一代[15－17]。在對貝類相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)，不同殼色貝類差異表達(dá)基因主要分布在色素合成、生長、免疫和生物礦化等相關(guān)信號通路，色素形成信號通路主要集中在黑色素合成途徑[18－20]。本課題組對不同殼色菲律賓蛤仔轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn):不同殼色蛤仔之間存在許多表達(dá)量顯著差異的基因，其中包括抗氧化酶家族基因如硫氧化還蛋白過氧化物酶 (TPx)、過氧化氫酶(CAT)、錳超氧化物歧化酶 (Mn－SOD)、銅鋅超氧化物歧化酶 (Cu/Zn－SOD)，以及熱休克蛋白家族基因HSP40、HSP75和小熱休克蛋白家族HSP22家族成員VpsHSP－1、VpsHSP－2等?？寡趸负蜔嵝菘说鞍准易宄蓡T在貝類對溫度、鹽度、低氧和環(huán)境污染物等脅迫的反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[21－24]，不同殼色菲律賓蛤仔所表現(xiàn)出的抗逆性差異可能與這些基因在不同殼色蛤仔中的表達(dá)量變化有關(guān)。因此，以不同殼色菲律賓蛤仔為研究對象，探討其在低氧條件下體內(nèi)抗氧化酶和熱休克蛋白家族成員基因的表達(dá)規(guī)律，以期對不同殼色蛤仔低氧耐受差異的機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用菲律賓蛤仔 (以下簡稱為蛤仔)采自遼寧省盤錦市，為實(shí)驗室繁育培養(yǎng)的蛤仔 (斑馬蛤、白蛤、白斑馬蛤)和采集的野生蛤仔，殼長為 (2.0±0.5)cm。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 挑選殼型完整且活力強(qiáng)的蛤仔，在50 L水體的平底塑料槽中暫養(yǎng)一周，水溫為(18±0.5)℃，鹽度為32，溶解氧為 (7.5±0.05)mg/L，每天換水一次，并投喂螺旋藻粉，持續(xù)充氧。

正式試驗時，從每種殼色蛤仔中隨機(jī)挑選24枚放置于塑料桶中，每種殼色蛤仔設(shè)置3個重復(fù)組，充入氮?dú)?，?dāng)氧氣濃度為(1.00±0.05)mg/L時停止，用保鮮膜對桶進(jìn)行密封處理。處理0、6、12、24 h時分別取蛤仔的鰓和外套膜組織，每個時間點(diǎn)隨機(jī)取5枚 (各50～100 mg)，迅速放入液氮中速凍后于超低溫冰箱 (－80℃)中保存?zhèn)溆谩?.2.2 蛤仔總RNA提取及cDNA合成 按天根公司動物組織總RNA抽提試劑盒說明書上的方法提取總RNA，產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖電泳檢測其完整性，并置于核酸分析儀 (Thermo Nanodrop2000c)下檢測A260nm/A280nm值。用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒對提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得相應(yīng)的cDNA。

1.2.3 引物設(shè)計 根據(jù)已獲得的蛤仔抗氧化酶基因家族和熱休克蛋白 (HSPs)基因家族的cDNA序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計實(shí)時熒光定量PCR引物 (表1)。所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.4 蛤仔抗氧化酶基因家族和熱休克蛋白基因家族實(shí)時熒光定量PCR表達(dá)分析 以Rp－tubulin為內(nèi)參基因，分析抗氧化酶基因家族和熱休克蛋白基因家族在低氧條件下的表達(dá)特征。試驗所用的cDNA模板根據(jù)所測濃度，按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)稀釋至一定濃度。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 (20 μL):SYBR?Premix Ex TaqTMII(TaKaRa)10 μL， cDNA 2.0 μL， 上、下游引物各 0.8 μL，用 ddH2O補(bǔ)足至 20 μL。采用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增:95℃下預(yù)變性30 s；95℃下變性5 s，60℃復(fù)性30 s，共40個循環(huán)。溶解曲線制備反應(yīng)條件:95℃變性5 s，60℃復(fù)性1 min，60～95℃以0.11℃/s的速度升溫，每度采集5個熒光信號；50℃下降溫30 s。每個反應(yīng)設(shè)置3個重復(fù)孔，以消除試驗誤差。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用2－ΔΔCt法計算4種殼色蛤仔鰓和外套膜組織中抗氧化酶基因和HSPs基因在低氧脅迫下相對表達(dá)量的變化。以野生蛤仔為對照組，其他3種殼色蛤仔抗氧化酶基因和HSPs基因的平均標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量均用對照組0 h未處理的表達(dá)量校準(zhǔn)。

表1 熒光定量PCR分析基因表達(dá)所用引物序列Tab.1 Sequences of primers used in RT－qPCR

采用SPSS 20.0軟件分析試驗結(jié)果，試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±S.D.)表示，采用單因素方差分析法進(jìn)行顯著性檢驗，用Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 低氧脅迫下4種殼色蛤仔外套膜組織中抗氧化酶家族基因的表達(dá)量分析

圖1 低氧脅迫下4種殼色蛤仔外套膜組織中抗氧化酶家族基因的相對表達(dá)量Fig.1 Relative expression levels of antioxidant gene family in the mantle of Manila clam Ruditapes philippinarum with four shell－colors exposed to the hypoxia

低氧脅迫下，不同殼色蛤仔外套膜中抗氧化酶家族基因的表達(dá)結(jié)果如圖1所示。從圖1可見:隨著低氧脅迫時間的延長，4種殼色蛤仔TPx表達(dá)量均表現(xiàn)出先升高后恢復(fù)的趨勢，其中野生蛤仔和斑馬蛤TPx表達(dá)量均在脅迫6 h時達(dá)到最高值 (P＜0.05)，白蛤和白斑馬蛤TPx表達(dá)量均在脅迫12 h時達(dá)到最高值 (P＜0.05)；白蛤TPx表達(dá)量在不同時間點(diǎn)均顯著高于其他3種殼色蛤仔 (P＜0.05)(圖1－A)。4種殼色蛤仔CAT表達(dá)量隨著低氧脅迫時間的延長均呈先升高后降低的趨勢，野生蛤仔和白蛤CAT表達(dá)量均在脅迫6 h時達(dá)到最高值(P＜0.05)，斑馬蛤和白斑馬蛤CAT表達(dá)量在脅迫12 h時達(dá)到最高值 (P＜0.05)；白斑馬蛤CAT表達(dá)量均在不同時間點(diǎn)均顯著高于其他3種殼色蛤仔(P＜0.05)(圖1－B)。 4種殼色蛤仔Mn－SOD表達(dá)量隨著低氧脅迫時間的延長均呈先升高后降低的趨勢，野生蛤仔和白斑馬蛤Mn－SOD表達(dá)量均在脅迫6 h時到最高值 (P＜0.05)，斑馬蛤和白蛤表達(dá)量均在脅迫12 h時達(dá)到最高值 (P＜0.05)(圖1－C)。4種殼色蛤仔Cu－ZnSOD表達(dá)量隨著低氧脅迫時間的延長均呈先升高后恢復(fù)的趨勢，野生蛤仔和白斑馬蛤的Cu－ZnSOD表達(dá)量均在脅迫6 h時達(dá)到最高值 (P＜0.05)，斑馬蛤和白蛤Cu－ZnSOD表達(dá)量均在脅迫 12 h時達(dá)到最高值 (P＜0.05)(圖 1－D)。

2.2 低氧脅迫下4種殼色蛤仔鰓組織中抗氧化酶家族基因的表達(dá)量分析

圖2 低氧脅迫下4種殼色蛤仔鰓組織中抗氧化酶家族基因的相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression levels of antioxidant gene family in the gill of Manila clam Ruditapes philippinarum with four shell－colors exposed to the hypoxia

低氧脅迫下，不同殼色蛤仔鰓中抗氧化酶家族基因的表達(dá)結(jié)果如圖2所示。從圖2可見:隨著低氧脅迫時間的延長，野生蛤仔TPx表達(dá)量均呈先升高后恢復(fù)的趨勢，在脅迫6 h時達(dá)到最高值(P＜0.05)；斑馬蛤、白蛤和白斑馬蛤受到脅迫后TPx表達(dá)量呈先下降后恢復(fù)的趨勢，均在6 h時達(dá)到最低值 (P＜0.05)，斑馬蛤TPx基因表達(dá)量在不同時間點(diǎn)均顯著高于其他3種殼色蛤仔 (P＜0.05)(圖2－A)。野生蛤仔CAT表達(dá)量隨著低氧脅迫時間的延長呈先升高后恢復(fù)的趨勢，在脅迫6 h時達(dá)到最高值 (P＜0.05)；而其他3種殼色蛤仔CAT表達(dá)量呈先降低后恢復(fù)的趨勢，均在脅迫6 h時達(dá)到最低值 (P＜0.05) (圖2－B)。野生蛤仔 Mn－SOD基因表達(dá)量隨著低氧脅迫時間的延長出現(xiàn)先升高后恢復(fù)的過程，在脅迫12 h時達(dá)到最高值(P＜0.05)；其他3種殼色蛤仔Mn－SOD表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢，白蛤在脅迫6 h時、斑馬蛤和白斑馬蛤在脅迫12 h時表達(dá)量均達(dá)到最低值(P＜0.05)(圖 2－C)。 野生蛤仔 Cu－ZnSOD 表達(dá)量隨著低氧脅迫時間的延長呈先升高后降低的趨勢，在脅迫12 h時表達(dá)量達(dá)到最高值 (P＜0.05)；其他3種殼色蛤仔表達(dá)量呈先降低后恢復(fù)的趨勢，均在脅迫6 h時表達(dá)量達(dá)到最低值 (P＜0.05)(圖2－D)。

2.3 低氧脅迫下4種殼色蛤仔外套膜組織中熱休克蛋白家族基因的表達(dá)量分析

低氧脅迫下，不同殼色蛤仔外套膜中熱休克蛋白家族基因的表達(dá)結(jié)果如圖3所示。從圖3可見:隨著低氧脅迫時間的延長，野生蛤仔、斑馬蛤和白斑馬蛤HSP40表達(dá)量均呈先升高后降低的趨勢，斑馬蛤在脅迫12 h時、野生蛤仔和白蛤脅迫6 h時HSP40表達(dá)量均達(dá)到最高值 (P＜0.05)；白斑馬蛤HSP40表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢，在脅迫6 h時表達(dá)量達(dá)到最低值 (P＜0.05)(圖3－A)。野生蛤仔、斑馬蛤和白斑馬蛤HSP75表達(dá)量隨著低氧脅迫時間的延長呈先升高后降低的趨勢，斑馬蛤在脅迫12 h時、野生蛤仔和白蛤在脅迫6 h時HSP75表達(dá)量均達(dá)到最高值 (P＜0.05)；白斑馬蛤HSP75表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢，在脅迫6 h時表達(dá)量達(dá)到最低值 (P＜0.05) (圖3－B)。野生蛤仔、斑馬蛤和白斑馬蛤VpsHSP－1表達(dá)量隨著低氧脅迫時間的延長呈先升高后降低的趨勢，斑馬蛤在脅迫12 h時、野生蛤仔和白蛤在脅迫6 h時表達(dá)量達(dá)到最高值 (P＜0.05)；白斑馬蛤VpsHSP－1表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢，在脅迫6 h時表達(dá)量達(dá)到最低值 (P＜0.05)(圖3－C)。野生蛤仔、斑馬蛤和白斑馬蛤VpsHSP－2表達(dá)量隨著低氧脅迫時間的延長呈先升高后降低的趨勢，斑馬蛤在脅迫12 h時、野生蛤仔和白蛤在脅迫6 h時表達(dá)量均達(dá)到最高值(P＜0.05)；白斑馬蛤VpsHSP－2表達(dá)量隨著低氧脅迫時間的延長呈先降低后升高的趨勢，在脅迫6 h時表達(dá)量達(dá)到最低值 (P＜0.05)(圖3－D)。

圖3 低氧脅迫下4種殼色蛤仔外套膜組織中熱休克蛋白家族基因的相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of heat shock protein gene family in the mantle of Manila clam Ruditapes philippinarum with four shell－colors exposed to the hypoxia

2.4 低氧脅迫下4種殼色蛤仔鰓組織中熱休克蛋白家族基因的表達(dá)量分析

低氧脅迫下，不同殼色蛤仔鰓組織中熱休克蛋白家族基因的表達(dá)結(jié)果如圖4所示。從圖4可見:隨著低氧脅迫時間的延長，野生蛤仔和白蛤鰓組織中HSP40表達(dá)量均呈先升高后降低的趨勢，野生蛤仔在低氧脅迫12 h時、白蛤在脅迫6 h時表達(dá)量均達(dá)到最高值 (P＜0.05)；斑馬蛤和白斑馬蛤HSP40表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢，在脅迫6 h時表達(dá)量達(dá)到最低值 (P＜0.05)(圖4－A)。野生蛤仔和白蛤鰓組織中HSP75表達(dá)量隨著低氧脅迫時間的延長呈先升高后降低的趨勢，野生蛤仔在脅迫12 h時、白蛤在脅迫6 h時表達(dá)量達(dá)到最高值(P＜0.05)；斑馬蛤和白斑馬蛤HSP75表達(dá)量呈先降低后升高再降低的趨勢，斑馬蛤在脅迫24 h時、白斑馬蛤在脅迫6 h時表達(dá)量達(dá)到最低值 (P＜0.05)(圖4－B)。野生蛤仔和白蛤VpsHSP－1表達(dá)量隨著低氧脅迫時間的延長呈先升高后降低的趨勢，野生蛤仔在脅迫12 h時、白蛤在脅迫6 h時表達(dá)量均達(dá)到最高值 (P＜0.05)；斑馬蛤和白斑馬蛤VpsHSP－1表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢，均在脅迫6 h時表達(dá)量達(dá)到最低值 (P＜0.05)(圖4－C)。野生蛤仔和白蛤VpsHSP－2表達(dá)量隨著低氧脅迫時間的延長呈先升高后降低的趨勢，野生蛤仔在脅迫12 h時、白蛤在脅迫6 h時表達(dá)量均達(dá)到最高值(P＜0.05)；斑馬蛤和白斑馬蛤VpsHSP－2表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢，均在脅迫6 h時表達(dá)量達(dá)到最低值 (P＜0.05)(圖4－D)。

3 討論

3.1 低氧脅迫對4種殼色蛤仔體內(nèi)抗氧化酶家族基因的影響

圖4 低氧脅迫下4種殼色蛤仔鰓組織中熱休克蛋白家族基因的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of heat shock protein gene family in the gill of Manila clam Ruditapes philippinarum with four shell－colors exposed to hypoxia

在呼吸過程中，有0.1%～0.2%的氧氣由體內(nèi)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化成活性氧 (ROS)[25]?；钚匝踝鳛橐环N具有高度活性的分子能夠氧化細(xì)胞成分，對于動物抵御病原微生物的感染具有重要作用[26]。低氧可以導(dǎo)致體內(nèi)電子的蓄積，為活性氧的形成提供便利，結(jié)果導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生較高水平的活性氧[27]。體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)在控制活性氧含量防止細(xì)胞氧化損傷方面具有重要作用[28]。體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)由抗氧化酶和其他 (非酶系統(tǒng))分子組成，用于清除體內(nèi)多余的活性氧。真核生物體內(nèi)的抗氧化酶家族是抵御活性氧的第一道防線，通過超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性氧轉(zhuǎn)化成超氧自由基(O2－·)再轉(zhuǎn)化成過氧化氫 (H2O2)，再由過氧化氫酶 (catalase，CAT)轉(zhuǎn)化成水，谷胱甘肽過氧化物酶 (glutathione peroxidase，GPx)、硫氧還原蛋白過氧化物酶 (thioredoxin peroxidase，TPx)和抗氧化蛋白 (peroxiredoxin，PRx)等也參與對過氧化物的解毒過程[26，29]。因此，抗氧化物酶表達(dá)量的高低，能夠反映出動物對低氧耐受能力的差異。

本研究中發(fā)現(xiàn)，4種殼色蛤仔在低氧脅迫期間體內(nèi)抗氧化酶具有顯著性波動過程，白蛤外套膜組織和斑馬蛤鰓組織中TPx基因表達(dá)量在脅迫的各個時間點(diǎn)均顯著高于其他3種殼色蛤仔。Zoysa等[21]在對低氧脅迫下皺紋盤鮑Haliotis discus discus轉(zhuǎn)錄組的分析發(fā)現(xiàn)，皺紋盤鮑鰓組織中CAT、TPx和SOD基因受到脅迫后表達(dá)量顯著升高。Woo等[30]對紫貽貝Mytilus galloprovincialis進(jìn)行低氧脅迫研究時發(fā)現(xiàn)，在2 mg/L低氧環(huán)境中，脅迫24 h時紫貽貝肌肉組織CAT、SOD基因表達(dá)量顯著降低。這表明，低氧會誘導(dǎo)抗氧化酶活性變化，導(dǎo)致氧化還原不平衡，進(jìn)一步誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。研究發(fā)現(xiàn)，人類體內(nèi)的活性氧能夠通過調(diào)節(jié)酪氨酸羥化酶的活性控制酚氧化酶的活性，進(jìn)而影響黑色素細(xì)胞內(nèi)真黑素和褐黑素的合成和分布，導(dǎo)致呈現(xiàn)不同深淺的膚色[31－32]。表皮內(nèi)的硫氧還蛋白還原酶/硫氧還原蛋白/硫氧還原蛋白過氧化物酶 (TR/T/TPx)系統(tǒng)能夠降低體內(nèi)過氧化氫的濃度，進(jìn)而減小活性氧對酪氨酸羥化酶的毒性作用[33]。對貝類殼色的相關(guān)研究表明，不同殼色貝類體內(nèi)的酪氨酸酶活性或表達(dá)量差異所導(dǎo)致的黑色素合成及分布的不同，是產(chǎn)生殼色變化的一個重要因素[24－26]。TPx基因的這種高表達(dá)量可能與這兩種殼色體內(nèi)具有相對多的黑色素含量及其對酪氨酸酶活性較高的依賴性所致。此外，研究表明，貝類的抗氧化酶系統(tǒng)具有高度的組織特異性[34－35]。鰓組織作為貝類的呼吸器官，具有一套完整有效的抗氧化防御體系，其中包括SOD、CAT等高效的抗氧化酶，TPx作為組分之一參與對ROS的反應(yīng)[36－37]。貝類外套膜的主要功能是參與貝殼的形成和色素沉積，其中黑色素形成過程所依賴的酪氨酸羥化酶活性主要通過TPx系統(tǒng)進(jìn)行保護(hù)[19，38]。因此，本研究中不同殼色蛤仔TPx基因表達(dá)量在鰓組織和外套膜組織中表現(xiàn)出不同的變化趨勢，可能與其在不同組織中的作用不同有關(guān)。

3.2 低氧脅迫對4種殼色蛤仔體內(nèi)熱休克蛋白家族基因的影響

通常情況下，在正常的生理狀態(tài)下，生物體內(nèi)持續(xù)表達(dá)的HSPs主要作為分子伴侶參與生物過程，在應(yīng)激條件下能夠被大量誘導(dǎo)以防止蛋白質(zhì)的聚合[39]。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，活性氧 (主要是H2O2)通過激活JAK/STAT信號通路誘導(dǎo)熱休克蛋白家族基因特別是HSP70和HSP90的表達(dá)，高水平的HSP70基因能夠提高受脅迫細(xì)胞或動物的存活能力[40－41]。HSP40作為一種伴侶蛋白基因，是HSP70家族基因行使其功能活動的重要輔助因子，通過促進(jìn)ATP水解來發(fā)揮作用，并能調(diào)節(jié)HSP70和多肽形成復(fù)合物，使非天然結(jié)構(gòu)的蛋白恢復(fù)天然結(jié)構(gòu)[10]。本研究中，在低氧脅迫條件下，4種殼色蛤仔體內(nèi)的HSP75和HSP40基因均表現(xiàn)出了升高的過程。David等[42]研究發(fā)現(xiàn)，長牡蠣Crassostrea gigas在30%氧含量的低氧環(huán)境中被脅迫3 d后，其外套膜、鰓組織中HSP70基因顯著升高。因此，可以推斷，蛤仔體內(nèi)HSP75和HSP40的升高是蛤仔對低氧的一種適應(yīng)性反應(yīng)。曲凌云等[43]對櫛孔扇貝Chlamys farreri進(jìn)行熱刺激后，其鰓組織中HSP70基因表達(dá)量發(fā)生顯著變化，而外套膜、肌肉和性腺組織中變化不顯著。福壽螺Pomacea canaliculata在受到高溫脅迫時，鰓組織中HSP60、HSP70和HSP90表達(dá)量顯著高于消化腺和肌肉組織中的表達(dá)量[25]。因此，本研究中，斑馬蛤鰓組織和外套膜組織中熱休克蛋白基因表達(dá)量變化趨勢不同與熱休克蛋白家族基因組織特異性有關(guān)。研究表明，櫛孔扇貝熱休克蛋白家族基因參與殼結(jié)構(gòu)中殼多糖合成，在貝類的生物礦化過程中具有重要作用[44－45]，而貝類殼色主要是由生物礦化過程形成的碳酸鈣晶體結(jié)構(gòu)以及其中的蛋白成分和色素所形成[20－21，46]。 本研究中， 在受到低氧脅迫后，同一熱休克蛋白基因在不同殼色蛤仔的相同組織中也表現(xiàn)出不同的變化趨勢，這可能與熱休克蛋白基因在蛤仔不同殼色形成過程中的功能差異有關(guān)。

4 結(jié)語

本研究中，在1 mg/L低氧脅迫后，蛤仔鰓組織和外套膜中抗氧化酶家族基因 (TPx、CAT、Mn－SOD、Cu/Zn－SOD)和熱休克蛋白家族基因(HSP40、 HSP75、 VpsHSP－1、 VpsHSP－2) 均表現(xiàn)出升高的過程，表明蛤仔體內(nèi)的這些基因參與了其對低氧的耐受過程。此外，白蛤外套膜組織中的TPx和HSP40基因，以及斑馬蛤鰓組織中TPx基因表達(dá)量在低氧脅迫的各個時間點(diǎn)均顯著高于其他3種殼色蛤仔，這些基因的高表達(dá)能夠提高蛤仔對活性氧的抵抗能力，對其體內(nèi)黑色素合成途徑具有重要的保護(hù)作用。黑色素合成能力的差異已被證實(shí)與貝類殼色的多樣性具有重要的相關(guān)性。因此，不同殼色蛤仔抗氧化酶基因和熱休克蛋白基因所表現(xiàn)出的表達(dá)差異，應(yīng)與其殼色之間存在某種關(guān)聯(lián)。白蛤和斑馬蛤在低氧脅迫過程中表現(xiàn)出相對較好的低氧耐受能力，對其具體的影響途徑和機(jī)制今后需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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