湛潤生，紀麗穎，邢寶龍，張旭麗

(1.山西大同大學生命科學學院，山西大同037009;2.山西大同大學設施農業(yè)技術研發(fā)中心，山西大同037009；3.山西省農業(yè)科學院高寒區(qū)作物研究所，山西大同037008）

凝集素（agglutinin）是一類含糖（少數例外）并能與糖專一結合的蛋白質，它具有凝集細胞和刺激細胞分裂的作用，廣泛存在于各種真菌、無脊椎動物、脊椎動物、人體以及某些病毒體內。常用的植物凝集素(PNA)，通常以其被提取的植物命名，如麥胚凝集素(WGA)、花生凝集素(PNA)、大豆凝集素(SBA)等[1-4]。在細胞表面，組成細胞膜的糖脂和糖蛋白伸出寡糖鏈，形成細胞外被（又被稱為糖萼）。凝集素能與細胞外被中的糖分子連接，在細胞間形成“橋”，從而引起細胞凝集[5－6]。

大豆凝集素（soybean agglutinin，SBA）是最早被描述的植物凝集素之一，利用凝集素與不同的糖蛋白特異性結合的原理，大豆凝集素在糖生物化學、血型鑒定、生物醫(yī)藥等領域有著廣泛應用[7-11]。同時作為大豆中主要抗營養(yǎng)因子之一，大豆凝集素可對動物腸壁、刷狀緣酶活性、小腸黏膜細胞代謝、腸道細菌生態(tài)物質代謝及免疫機能產生一定的影響[12]。因此開展大豆凝集素提取工藝及凝集活性檢測實驗尤為重要，本實驗采用生理鹽水提取的方法分離純化得到大豆凝集素樣品，并對其血凝活性進行了研究，旨在探索不同大豆凝集素含量的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大豆由山西省農業(yè)科學院高寒區(qū)作物研究所提供，分別是晉科5號、晉豆25號、長豆34號、晉遺57號和晉遺59號。

1.2 主要試劑

0.9 %NaCl溶液；肝素鈉注射液（河南省國藥醫(yī)藥有限公司）。

1.3 主要儀器

冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；電子天平（上海精科天美科學有限公司)；生物顯微鏡CKX41（日本OLYMPUS公司）；分光光度計（上海博迅實業(yè)有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫(yī)療設備有限公司）。

1.4 實驗方法

主要依據參考文獻[13－15]進行。

1.4.1 大豆中凝集素的提取及其純化

稱取不同品種大豆10g，用0.9%NaCl溶液清洗干凈，加入100 mL 0.9%NaCl溶液在4℃的冰箱中浸泡24h，用研缽將大豆研碎。在大豆粉中加入100 mL 0.9%NaCl溶液，置于4℃冰箱中放置一夜抽提。將大豆混合物用4層紗布過濾，將過濾好的濾液放到5 000 r∕min冷凍離心機中離心20 min。將上清液轉移到燒杯中，4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 紅細胞懸液的制備

以無菌方法抽取兔耳緣靜脈血液（5 mL注射器先吸取3 mL 1%肝素溶液）1 mL，用0.9%NaCl溶液洗滌5次，每次3 000 r∕min離心5 min，最后按沉淀紅細胞體積用0.9%NaCl溶液配成2%紅細胞懸液。

1.4.3 血凝反應的測定

吸取大豆凝集素提取液和紅細胞懸液各1滴在載玻片上，充分混勻，靜置15 min，在光學顯微鏡下觀察凝集效果。并用0.9%NaCl溶液作為空白對照，觀察凝血效果。

1.4.4 凝集素相對含量的測定

1）將相同體積試管洗凈滅菌后烘干稱重，然后向各管內分別加入不同品種大豆凝集素提取液5 mL，并且用0.9%NaCl溶液做對照實驗。

2）在各試管內同時加入1 mL的2%的紅細胞懸液，充分搖晃均勻，15 min內觀察紅細胞的凝集情況。

3）在其中一種豆子中的紅細胞團最先完全積淀的同一時刻，取出每個試管中的一部分上液，使每一個試管內的溶液都維持在同一刻度。與此同時再向各個試管內取2 mL的溶液于比色皿中，于分光光度計內測定其在620 nm時的吸光度值（OD）。

4）將每個試管中的溶液全部用膠頭滴管取出，此時試管中只有紅細胞凝塊，然后再將試管放入烘干箱內烘干后稱重。

1.4.5 凝集程度的判別與記錄

試管內的溶液是清澈的，液體內的血紅細胞在試管底部完全凝集后，輕輕搖晃試管時，可在試管內見到大的凝塊，為高度凝集（++）；試管內的液體渾濁，試管底部可觀察到較小的凝塊，為輕度凝集（+）；試管內的液體中的紅細胞分布均勻，試管底部未觀察到凝塊，為不凝集（－）。

2 結果與分析

2.1 細胞凝集反應

吸取凝集素提取液和紅細胞懸液各1滴在載玻片上，混均，靜置15 min，觀察結果見表1。

表1 凝集素提取液與2%的紅細胞懸液的凝集反應情況

可以看出，除0.9%NaCl、晉遺59號外，其他4種大豆凝集素提取液都使得紅細胞懸液有不同程度的凝集。晉科5號、長豆34號使得紅細胞凝集程度最高，證明其凝集素含量最高；晉豆25號、晉遺57號使得紅細胞凝集程度次之，證明其凝集素含量相對較低。

2.2 發(fā)生凝集反應后上清液的吸光值

發(fā)生凝集反應后，在各試管內取2 mL溶液放入比色皿中，于分光光度計內測定其在620 nm時的吸光值（OD）。見表2。

表2 凝集素與2%紅細胞懸液作用后上清液吸光值

當大豆中凝集素含量高時，凝集素使得溶液中的紅細胞大量凝集，發(fā)生凝集反應后溶液澄清，吸光度值較?。环粗?，當凝集素含量低時，溶液中的紅細胞較少凝集，溶液渾濁，吸光度值較大?？傮w來說，不同品種大豆凝集素含量順序為：晉科5號＞長豆34號＞晉豆25號、晉遺57號＞晉遺59號。

2.3 凝集紅細胞沉淀的干重

發(fā)生凝集反應后，用膠頭滴管將試管內的溶液全部吸走，試管內余下紅細胞凝塊，將試管及血凝塊一起放入烘干箱內烘干稱重。

大豆中凝集素含量較高時，實驗中血凝反應效果明顯，紅細胞的凝集團較大，最后所得凝集紅細胞沉淀的干重較大。反之，凝集素含量低時，血凝反應的效果不明顯，紅細胞的凝集團較小，最后所得沉淀的干重較小。凝集素含量順序為，晉科5號＞長豆34號＞晉豆25號＞晉遺57號＞晉遺59號。見表3。

表3 凝集紅細胞沉淀的干重/mg

3 討論與結論

本實驗采用山西省廣泛種植的幾種大豆為實驗材料，以0.9%NaCl溶液為提取劑。經過簡單的前期提取過程，通過觀察紅細胞凝集狀況，來初步區(qū)分凝集素含量的高低；再通過測定吸光度值和凝集紅細胞干重，來進一步區(qū)分不同品種大豆凝集素相對含量的高低。實驗過程表明，0.9%NaCl溶液作為提取劑對凝集素的活性影響較小，所得結果準確；兔血對血液的凝集反應也有較高的靈敏性。同時實驗結果表明，不同品種大豆凝集素含量區(qū)分明顯，晉科5號含量最高，長豆34號含量含量次之，晉豆25號和晉遺57號含量相對較低，晉遺59號含量最低。相信隨著科技不斷發(fā)展，新技術的不斷涌現，今后對于大豆凝集素的提取方法會越來越精確，同時也會發(fā)現越來越多的關于大豆凝集素在生物學方面的應用。

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