王雅麗， 王 亨， 崔璐瑩， 孟 霞， 李建基

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 江蘇 揚(yáng)州 225009 ；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009 )

鉤端螺旋體病(Leptospirosis)是由一類致病性問號(hào)鉤端螺旋體引起的一種人獸共患病，在溫?zé)帷⒊睗竦沫h(huán)境下發(fā)病率較高。 其臨床表現(xiàn)差異較大，有肝炎、心肌炎、腎衰竭等。 2017 年9 月?lián)P州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院接診1 只雄性泰迪犬，通過臨床檢查和分子生物學(xué)診斷，最終確診為鉤端螺旋體感染。 經(jīng)3 周治療后，該犬康復(fù)，為臨床診療提供資料，總結(jié)如下。

1 發(fā)病情況

2017 年9 月22 日，揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院接診1只雄性泰迪犬，年齡1.5 歲，體重3.5 kg。 臨床檢查發(fā)現(xiàn)：該犬體溫39.4 ℃，呼吸及脈搏正常，精神沉郁，小便帶血，呈深茶色，大便正常。

2 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)及診斷

2.1 血常規(guī)檢查 采取犬前肢頭靜脈外周血進(jìn)行血常規(guī)檢查，結(jié)果可見白細(xì)胞總數(shù)、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)及其百分比升高，淋巴細(xì)胞百分比降低；平均血紅蛋白量升高(見表1)。

2.2 血液生化檢查 結(jié)果顯示：谷草轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶顯著升高；谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰氨轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、間接膽紅素和總蛋白等不同程度升高(見表2)。

2.3 尿常規(guī)檢查 通過導(dǎo)尿采集病犬的尿液，進(jìn)行尿常規(guī)檢查，結(jié)果顯示，尿液pH 值升高、其中白細(xì)胞、紅細(xì)胞、酮體、膽紅素、尿膽原及蛋白質(zhì)均為陽性(見表3)。

2.4 尿沉渣檢查 尿液內(nèi)有少量紅細(xì)胞、鳥糞石結(jié)晶及大量革蘭陽性細(xì)菌。

表1 犬血常規(guī)檢查結(jié)果

表2 犬血液生化檢驗(yàn)結(jié)果

2.5 分子生物學(xué)診斷

2.5.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)參考文獻(xiàn)[2]報(bào)道的引物序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增問號(hào)鉤端螺旋體LigB 基因的特異性引物，送至南京擎科技術(shù)有限公司合成，目的條帶大小為124 bp。

表3 犬尿常規(guī)檢查結(jié)果

上游引物：5′-CTTGGGATTCTTCTAATMCSGATA-3′；

下游引物：5′-GATCCTTGTATTCCACCGATG-3′。

2.5.2 DNA 提取 采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的EasyPure Genomic DNA Kit 試劑盒，取患犬尿液及疫苗，提取鉤端螺旋體DNA，再進(jìn)行PCR 反應(yīng)。

2.5.3 PCR 反應(yīng) 反應(yīng)體系：2 ×EasyTaq PCR Super Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA 模板2 μL，補(bǔ)ddH2O 至25 μL。

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個(gè)循環(huán)，最后延伸72 ℃5 min。

2.5.4 PCR 電泳結(jié)果 使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，結(jié)果顯示，病犬尿液提取物電泳后出現(xiàn)目的條帶，與陽性對(duì)照條帶符合，且陰性對(duì)照無條帶，PCR 產(chǎn)物送至南京擎科技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫基因序列進(jìn)行比對(duì)，與問號(hào)鉤端螺旋體已公布的基因型同源性高達(dá)99%。 判定該犬為問號(hào)鉤端螺旋體陽性(見圖1)。

圖1 鉤端螺旋體PCR 檢測(cè)結(jié)果

3 診斷結(jié)果

經(jīng)過臨床檢查及分子生物學(xué)診斷，該犬確診為鉤端螺旋體感染繼發(fā)細(xì)菌感染。

4 治療

對(duì)因治療，靜脈注射青霉素及口服多西環(huán)素，連用2 周。 對(duì)癥治療，根據(jù)病犬出現(xiàn)的不同癥狀，對(duì)癥治療。

5 轉(zhuǎn)歸

經(jīng)過治療，分別在第8 天、第20 天進(jìn)行血常規(guī)和生化檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：白細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量下降至正常，谷氨酰氨轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素及直接膽紅素等指標(biāo)逐漸恢復(fù)正常，飲食恢復(fù)，精神狀態(tài)無異常。

6 討論

鉤端螺旋體病廣泛傳播于世界各地，主要感染哺乳動(dòng)物，包括人、家畜及犬等，許多野生動(dòng)物是鉤端螺旋體的攜帶者與傳播者。 研究表明，犬是將鉤端螺旋體傳播給人的重要來源[2]。 患犬通過皮膚黏膜傷口感染或由接觸病原攜帶者尿液或被尿液污染的水或土壤而感染。 鉤端螺旋體進(jìn)入體內(nèi)后，可在腎臟中長(zhǎng)期生長(zhǎng)增殖，并通過尿液向環(huán)境中排出病原。 根據(jù)調(diào)查，發(fā)病犬多為1 歲以上，經(jīng)常在室外活動(dòng)的犬，雄犬發(fā)病率高于雌犬，且未去勢(shì)的犬發(fā)病率較高[3-4]，但也有調(diào)查顯示，患病雌犬多于雄犬[2]。

該病在犬上常表現(xiàn)為肝臟、腎臟的慢性或急性炎癥，甚至功能衰竭，也可以表現(xiàn)為特發(fā)性多尿、多飲的慢性攜帶狀態(tài)[5-7]。 常見臨床癥狀為嘔吐、腹瀉、發(fā)熱、黃疸、氮質(zhì)血癥等。 本次確診的病例與上述癥狀相符合，生化檢查結(jié)果總膽紅素與直接膽紅素均升高，表明其出現(xiàn)肝細(xì)胞性黃疸，同時(shí)谷草轉(zhuǎn)氨酶及谷丙轉(zhuǎn)氨酶也有所升高，即肝功能受到影響。 而該犬腎臟生化指標(biāo)未見異常，這可能與疾病的發(fā)現(xiàn)及時(shí)有關(guān)。 而尿液中的紅細(xì)胞及白細(xì)胞陽性可能主要是由于細(xì)菌感染導(dǎo)致。

目前，對(duì)于鉤端螺旋體病常見的診斷方法有顯微鏡檢查、分離培養(yǎng)、顯微凝集測(cè)試(MAT)、動(dòng)物接種試驗(yàn)及PCR 方法等。 相較于其他方法、PCR 法更加快捷，且準(zhǔn)確性更佳，因此可采用此方法作為該病的主要診斷途徑。

有研究表明，青霉素和多西環(huán)素對(duì)鉤端螺旋體病治療效果較好，多西環(huán)素還可作為在易感情況下的短期預(yù)防藥物[6]。 本次治療在使用青霉素和多西環(huán)素等抗生素的同時(shí)，還使用保肝護(hù)腎等藥物對(duì)癥治療。 連續(xù)用藥1 周后，癥狀開始減輕，精神也逐漸好轉(zhuǎn)，3 周后恢復(fù)正常。

鉤端螺旋體病是重要的人獸共患病，因此，應(yīng)對(duì)寵物鉤端螺旋體病加以重視，防止寵物和人之間的互相傳染。