柳園，李晶晶，石磊，馬亞，胡雯

四川大學華西醫(yī)院 臨床營養(yǎng)科，四川 成都 610041

血脂異常(dyslipidemia)是指由于機體脂質(zhì)合成增加和/或血液中脂質(zhì)清除能力減弱而導致的一種代謝障礙性疾病。國內(nèi)外大量指南共識提出血脂異常是眾多心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的獨立危險因素，CVD已經(jīng)成為危害人類健康最為嚴重的疾病之一，針對心血管疾病防治的研究十分必要[1-5]。益生菌通過產(chǎn)生膽鹽水解酶、與膽固醇結合、粘附、轉(zhuǎn)化等機制調(diào)節(jié)腸道功能參與體內(nèi)膽固醇代謝，改善血脂水平，益生菌也成為了防治CVD的一種潛在手段[6-8]。本研究所使用的鼠李糖乳桿菌grx10(Lactobacillusrhamnosusgrx10，簡稱grx10)由我國自主篩選，其降血脂的健康效益已經(jīng)在體外實驗和動物研究中得到了驗證，目前尚未見人體的相關文獻報道[9]。因此，本課題擬采用隨機、雙盲、安慰劑對照研究，旨在觀察grx10對血脂水平的改善作用，為血脂代謝異常達到用藥指針前的非藥物干預及CVD防治提供新的思路。臨床試驗注冊號為ChiCTR-IIR-15007384。

1 對象與方法

1.1受試者的選擇

1.1.1納入標準 (1)年齡≥18歲；(2)參考《中國成人血脂異常防治指南2016版》，選擇血清膽固醇水平達到邊緣升高的低危、中危人群為本研究的受試對象，即血脂檢測總膽固醇(TC)為5.2～7.2 mmol/L，和(或)低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)為3.4～4.9 mmol/L；(3)簽訂知情同意書，自愿參加試驗者。

1.1.2排除標準 根據(jù)益生菌代謝特點及生物醫(yī)學倫理要求，并依照ASCVD發(fā)病危險分層[1]，排除可能被列為高危、極高危人群的因素，匯總排除標準：(1)已診斷患有ASCVD、高血壓和/或糖尿病者；(2)BMI>28 kg/m2者；(3)過敏體質(zhì)，尤其乳制品過敏或不耐受者；(4)妊娠、哺乳期或更年期婦女；(5)具有早發(fā)缺血性心血管病家族史者，或合并有心、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴重疾病，精神病患者；(6)研究期間食用除本菌粉外的其他各種形式的含益生菌的食品或產(chǎn)品，如酸奶等；(7)研究期間服用抗生素者；(8)近2周曾服用調(diào)脂藥物，影響到對結果的判斷者；(9)患有消化系統(tǒng)疾病，如胃腸道感染、胃腸道潰瘍者；(10)住院的血脂異常者；(11)未按規(guī)定食用受試樣品，或資料不全，影響功效或安全性判斷者；(12)研究者認為不適合參加本研究的其他志愿者。

1.2研究方法與內(nèi)容

1.2.1研究方法 將篩選出符合納入排除標準的受試對象，隨機分為對照組、低劑量組、高劑量組。對照組每日食用安慰劑(脫脂乳粉)10 g/d，低劑量組每日食用grx10粉劑4 g/d(活菌量為3.2×1010CFU/d)以及安慰劑6 g/d，高劑量組每日食用grx10粉劑10 g/d(8.0×1010CFU/d)。試驗周期：2周洗脫期+6周干預期。所有納入對象在正式接受干預前需經(jīng)歷2周的洗脫期，要求不攝入任何含有益生菌的食品。在干預期間，也要求受試對象不攝入干預樣品之外的含有益生菌的產(chǎn)品。所有受試對象在入組前、干預期結束后均接受我院營養(yǎng)醫(yī)師的飲食調(diào)查；在入組前及試驗結束后進行血液指標檢測。為保證研究對象的飲食及生活習慣在入組前后無差異，整個試驗期間不為受試者提供飲食及生活方式建議。

受試對象所有血液采用全自動生化檢測儀進行檢測。營養(yǎng)師負責收集患者的飲食記錄結果。

1.2.2觀察指標 (1)基本信息：姓名、年齡、性別、教育程度、職業(yè)、身高、體重、吸煙、飲酒情況、體育活動情況等；(2)應用中國成人血脂異常防治指南推薦的高脂血癥患者膳食評價表評估膳食情況，評分總和<3分為合格，3～5分為輕度膳食不良，≥6分為嚴重膳食不良；(3)血清TC、LDL-C、HDL-C(高密度脂蛋白膽固醇)、TG(甘油三酯)檢測結果；(4)血常規(guī)、肝、腎功能等安全性指標檢查及不良反應監(jiān)測。

1.3質(zhì)量控制 研究者根據(jù)隨機數(shù)字表法隨機分配受試對象的入組情況，每位受試對象以編號來區(qū)分，不同組別的干預物以A、B、C區(qū)分，所有結果在試驗結束后揭盲。采用雙人雙錄入法進行數(shù)據(jù)錄入，錄入完畢后對數(shù)據(jù)庫進行糾錯。

2 結 果

2.1一般情況 招募符合納入排除標準70人，其中15人由于個人原因未能堅持服用，6人因身體不適而中止試驗，5人因干預中途使用降脂藥物或抗生素而中止試驗。最終完成試驗44人。其中高劑量組17人，低劑量組14人，安慰劑組13人；男14人，女30人；年齡為20～64歲，平均年齡(43.34±11.11)歲，均為原發(fā)性血脂升高者，不伴有其他慢性病。

2.2干預前組間基線情況比較 試驗開始前三組志愿者組間性別、年齡、體重、BMI、吸煙率、飲酒率、體育活動率、空腹血糖、血脂等比較差異均無統(tǒng)計學意義。見表1。

2.3干預后受試者基本情況組內(nèi)比較 對受試者的體重、BMI、吸煙率、飲酒率、體育活動率、膳食得分進行組內(nèi)比較，結果顯示除高劑量組體重及BMI干預后顯著降低外，其余指標差異無統(tǒng)計學意義(表1vs表2)。

表1 干預前三組研究對象組間基線情況比較

表2 干預結束后研究對象飲食、生活方式變化

注：a：與自身干預前比較。

2.4干預后血脂指標變化 各組組內(nèi)干預前后比較：經(jīng)自身配對t檢驗，與干預前相比，grx10高劑量干預組血清TC、TG、LDL-C顯著下降[TC(5.66±1.44)mmol/L，P=0.0138；TG(1.57±0.67)mmol/L，P=0.0091；LDL-C(2.98±1.18)mmol/L，P=0.0262]，HDL-C差異無統(tǒng)計學意義[(1.81±0.77)mmol/L，P=0.0672]；低劑量組、安慰劑組組內(nèi)比較，干預前后血脂指標差異均無統(tǒng)計學意義。

干預后三組組間比較：將高、低劑量組干預后的血脂值分別與安慰劑組比較，t檢驗顯示高劑量組干預后TG指標顯著下降[(1.57±0.67)mmol/L，P=0.0306]，但TG改變差值及其余血脂指標差異均無統(tǒng)計學意義。見表3。

2.5安全性指標及不良反應監(jiān)測 干預過程中，對所有受試對象血常規(guī)、肝功能、腎功能、空腹血糖等指標進行監(jiān)測，干預前后上述指標差異均無統(tǒng)計學意義。

3 討 論

本次隨機、雙盲、安慰劑對照試驗結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過6周的干預，高劑量grx10組組內(nèi)前后對照TC、TG、LDL-C差異有統(tǒng)計學意義。將高低劑量組血脂變化分別與安慰劑組比較，發(fā)現(xiàn)組間血脂變化差異無統(tǒng)計學意義。三組間的有關飲食、行為、生活方式指標，如體重、BMI、吸煙率、飲酒率、體育活動率、血脂異常膳食得分等差異均無統(tǒng)計學意義 。綜上，研究結果顯示當grx10達到較高劑量時可以降低血清TC、TG、LDL-C水平，但是尚不能說明grx10干預與安慰劑組的作用有差異?？赡艿脑蛴校?/p>

3.1疾病嚴重程度較低 本次研究旨在觀察grx10的單獨效應，綜合生物醫(yī)學倫理要求，建議血脂水平達到邊緣升高的下限并且經(jīng)危險度評定后ASCVD中、低危且未服藥人群參加本項目。Greany等[10]和Ivey等[11]的RCT研究觀察益生菌對健康人群血脂水平影響，疾病嚴重程度低可能是得到陰性結果的原因。Fuentes等[7]的開展的臨床試驗得出結論，患者的TC水平越高，益生菌降低CVD風險的效果越好。由于臨床試驗設計差異較大，Meta分析將不同研究中受試者的血脂基線進行亞組分析，同樣指出益生菌對血脂TC較高人群的干預效果更明顯[12-13]。盡管如此，為了受試者的安全考慮，我們納入研究對象疾病嚴重程度較低，這可能影響了grx10的干預效果。

表3 干預后血脂指標變化

注：a：組內(nèi)干預前后自身配對t檢驗；b：高、低劑量組分別與安慰劑組比較。

3.2依從性較低，樣本量小 本次研究采用公共網(wǎng)絡平臺招募的形式納入受試人群，未能如期堅持服用益生菌的人數(shù)較多，同時，受試人群血脂升高程度較低，隨著時間的推移研究對象對自己血脂水平的關注度下降，使得本研究失訪率較高。依從性是影響干預結果的因素之一。由于此次研究是grx10首次應用于人體，我們的納入排除標準較為嚴格，限制了志愿者的入組，使得樣本量較小，未來仍然需要大樣本臨床試驗支持益生菌的人體功效。

3.3飲食和生活方式等混雜因素較多 血脂水平異常的治療性生活方式改變包括控制體重、戒煙、限酒和堅持規(guī)律的中等強度代謝運動[1]，無論是否使用調(diào)脂藥物，飲食治療和改善生活方式是血脂異常治療的基礎措施[14]。為控制這些混雜因素，本項目研究人員沒有給受試者提供相關建議，但從干預前后吸煙、飲酒率來看，研究對象沒有主動做出改變；通過血脂異常者膳食得分量表的評價也可以看出，受試者沒有限制飲食中飽和脂肪含量較高，可能升高膽固醇的食物；體育活動率在干預結束后出現(xiàn)下降，也進一步說明受試者難以堅持非藥物的治療方式，依從性不高。

3.4劑量及療程 目前對于益生菌的服用劑量尚無一個明確的標準。由于菌株特異性，不同的益生菌菌株、同一株益生菌不同劑量、不同干預周期或不同人群，對益生菌的效果相差影響很大。我國《益生菌類保健食品申報與審評規(guī)定》指出益生菌類食品保質(zhì)期內(nèi)的活菌數(shù)≥106CFU/mL(g)。大部分關于益生菌降血脂的RCT試驗采用108～1010CFU/d的益生菌劑量，相關研究大都處于劑量摸索階段，故研究者多設置高、低劑量組來評估益生菌的效果。Sharafedtinov等[15]的RCT研究益生菌劑量達7.5×1012CFU/d，有可能我們目前所使用的干預劑量不是這一菌株作用于人體的最佳劑量。此外，益生菌與血脂的Meta分析指出多種菌株混合、干預周期長，比單一菌株、干預周期短降脂效果更好[12-13]，但我們同時需要考慮長時間使用可能發(fā)生的安全性問題[16]。

[1] 諸駿仁, 高潤霖, 趙水平, 等. 中國成人血脂異常防治指南(2016年修訂版)[J]. 中國循環(huán)雜志, 2016(10):937-953.

[2]Miller M, Stone NJ, Ballantyne C, et al. Triglycerides and cardiovascular disease：A scientific statement from the American Heart Association[J]. Circulation, 2011, 123(20): 2292-2333.

[3]Jacobson TA, Ito MK, Maki KC, et al. National lipid association recommendations for patient-centered management of dyslipidemia: Part 1-full report[J]. J Clin Lipidol, 2015, 9(2): 129-169.

[4]Stone NJ, Robinson JG, Lichtenstein AH, et al. 2013 ACC/AHA guideline on the treatment of blood cholesterol to reduce atherosclerotic cardiovascular risk in adults: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines[J]. J Am Coll Cardiol, 2014, 63(25 Pt B): 2889-2934.

[5]Catapano AL, Graham I, De Backer G, et al. 2016 ESC/EAS Guidelines for the Management of Dyslipidemias: The Task Force for the Management of Dyslipidemias of the European Society of Cardiology(ESC) and European Atherosclerosis Society(EAS) Developed with the special contribution of the European Association for Cardiovascular Prevention & Rehabilitation(EACPR)[J]. Atherosclerosis, 2016, 253: 281-344.

[6]Jones ML, Martoni CJ, Prakash S. Cholesterol lowering and inhibition of sterol absorption byLactobacillusreuteriNCIMB 30242: A randomized controlled trial[J]. Eur J Clin Nutr, 2012, 66(11): 1234-1241.

[7]Fuentes MC, Lajo T, Carrión JM, et al. Cholesterol-lowering efficacy ofLactobacillusplantarumCECT 7527, 7528 and 7529 in hypercholesterolaemic adults[J]. Br J Nutr, 2013, 109(10): 1866-1872.

[8]Rerksuppaphol S. A randomized double-blind controlled trial ofLactobacillusacidophilusplusBifidobacteriumbifidumversus placebo in patients with hypercholesterolemia[J]. J Clin Diagnostic Res, 2015, 9(3): 1-4.

[9]顧瑞霞, 朱小紅, 楊振泉, 等. 具有降膽固醇及抑菌能力的鼠李糖乳桿菌grx10及其制備方法、用途[P]. 中國: CN101328470A, 2008-12-24.

[10] Greany KA, Bonorden MJ, Hamilton-Reeves JM, et al. Probiotic capsules do not lower plasma lipids in young women and men[J]. Eur J Clin Nutr, 2008, 62(2): 232-237.

[11] Ivey KL, Hodgson JM, Kerr DA, et al. The effect of yoghurt and its probiotics on blood pressure and serum lipid profile: A randomised controlled trial[J]. Nutr Metab Cardiovasc Dis, 2015, 25(1): 46-51.

[12] Cho YA, Kim J. Effect of probiotics on blood lipid concentrations[J]. Medicine, 2015, 94(43): e1714.

[13] Sun J, Buys N. Effects of probiotics consumption on lowering lipids and CVD risk factors: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J]. Ann Med, 2015, 47(6): 430-440.

[14] 諸駿仁. 正確認識合理使用調(diào)脂藥物[J]. 中華心血管病雜志, 2001(12): 4-5.

[15] Sharafedtinov KK, Plotnikova OA, Alexeeva RI, et al. Hypocaloric diet supplemented with probiotic cheese improves body mass index and blood pressure indices of obese hypertensive patients-a randomized double-blind placebo-controlled pilot study[J]. Nutr J, 2013, 12(1): 138.

[16] Boyle RJ, Robins-Browne RM, Tang ML. Probiotic use in clinical practice: What are the risks?[J]. Am J Clin Nutr, 2006, 83(6): 1256-1264, 1446-1447.