曹 丁，黃樂天，李學(xué)優(yōu)，黃魁英，張宜靖，夏楓耿

（廣州市微生物研究所，廣東廣州510663）

抗菌肽又稱抗微生物肽，是指廣泛存在于生物體內(nèi)，能抵抗外界病原菌侵害，具有多種免疫活性的先天性防御小分子多肽類物質(zhì)（Nakatsuji等，2012）?？咕姆肿淤|(zhì)量小，水溶性好，熱穩(wěn)定性高，天然無免疫原性，且抗菌譜廣，還具有抗腫瘤病毒和免疫調(diào)節(jié)活性（Ganz，2003）。此外，抗菌肽不易產(chǎn)生耐藥性，可有效解決抗生素濫用導(dǎo)致的耐藥性菌株增加和禽畜產(chǎn)品中出現(xiàn)抗生素殘留等問題（Cao 等，2010）。

多種動(dòng)物致病菌有良好的殺菌效果，且對(duì)陰性致病菌的效果優(yōu)于陽性致病菌。與基因工程類或天然抗菌肽相比，表達(dá)穩(wěn)定，且可耐受115℃高溫，對(duì)酸堿和蛋白酶耐受性較好，可到達(dá)腸道發(fā)揮作用而不失活。

在抗菌肽制劑制備方面，與真空冷凍干燥技術(shù)相比，噴霧干燥方法具有干燥能耗較少、生產(chǎn)效率較高、成本低、可連續(xù)進(jìn)料等優(yōu)點(diǎn) （付博等，2012），適合工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)，且所得粉末制劑含水量低，可以長期穩(wěn)定保存（Gardiner等，2000）。因此，本研究對(duì)有一定熱穩(wěn)定性的產(chǎn)抗菌肽的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液進(jìn)行噴霧干燥處理，制成高活性、易于運(yùn)輸貯存的粉末制劑?？咕膰婌F粉最重要的技術(shù)指標(biāo)是殺菌效價(jià)，而制劑水分含量則是決定其儲(chǔ)存期長短的重要因素。本研究運(yùn)用壓力噴霧干燥機(jī)，對(duì)經(jīng)微囊化的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液進(jìn)行干燥處理，并對(duì)噴霧干燥過程中的主要影響因素如吸附劑（保護(hù)劑）的種類、吸附劑的濃度、噴霧的出風(fēng)溫度和進(jìn)風(fēng)溫度進(jìn)行了優(yōu)化，確定其最佳噴霧干燥工藝條件，以提高產(chǎn)品得率、減少損失，同時(shí)獲得性能穩(wěn)定、易于運(yùn)輸和保存的粉末制劑產(chǎn)品，并對(duì)抗菌肽粉末制劑作為飼料添加劑應(yīng)用于仔豬養(yǎng)殖的效果進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 供試菌 產(chǎn)抗菌肽的枯草芽孢桿菌GL08和大腸桿菌K12D31由廣東省微生物種質(zhì)資源庫保存。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母抽提物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，pH=7.0，固體培養(yǎng)基加20 g/L的瓊脂粉。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 30 g/L，蔗糖20 g/L，國產(chǎn)酵母膏30 g/L，黃豆餅粉10 g/L，氯化鈉1 g/L，磷酸二氫鉀0.8 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，碳酸鈣4 g/L，pH=6.7。效價(jià)檢測用培養(yǎng)基：氯化鈉 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，葡萄糖5 g/L，瓊脂粉 20 g/L，pH=7.0。

酵母抽提物，胰蛋白胨：英國 Oxoid公司；瓊脂粉：廣州環(huán)凱生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器設(shè)備 生化培養(yǎng)箱，DHZ-DA大容量全溫振蕩器，752N型紫外可見分光光度計(jì)，50、500、5000 L不銹鋼發(fā)酵罐，壓力噴霧干燥機(jī)，顯微鏡，電子天平，pH計(jì)等。

1.4 GL08菌株噴霧發(fā)酵液的制備 將斜面保存的GL08菌株接種于種子培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，然后以1%的接種量接種于50 L發(fā)酵罐中，并經(jīng)過500、5000 L發(fā)酵逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，至穩(wěn)定期后期結(jié)束培養(yǎng)，培養(yǎng)過程分別取樣檢測各種生理指標(biāo)。

1.5 GL08菌株發(fā)酵液的噴霧干燥 將一定比例的保護(hù)劑加入待干燥的枯草芽孢桿菌GL08菌株發(fā)酵液中，用攪拌罐充分?jǐn)嚢杌靹?，待保護(hù)劑溶解完全，可進(jìn)行噴霧干燥。噴霧過程料液保持低速攪拌，保證粉末質(zhì)量均一。

采用壓力噴霧干燥塔，進(jìn)風(fēng)流量保持在40000 m3/h，高壓泵壓力為10～15 MPa。首先設(shè)置噴霧干燥器的進(jìn)風(fēng)溫度，然后開機(jī)預(yù)熱，當(dāng)塔內(nèi)進(jìn)口溫度達(dá)到設(shè)定溫度時(shí)，開啟高壓泵和噴槍，將料液以一定的流速泵入噴霧塔中，以此來控制出風(fēng)溫度。干粉儲(chǔ)存于旋風(fēng)分離器下收集袋中，將干粉收集密封于室溫干燥陰涼處保存。

1.6 噴霧干燥工藝的優(yōu)化

1.6.1 噴霧干燥保護(hù)劑的選擇 采用同一批發(fā)酵液作為噴霧料液，選擇麥芽糊精、玉米淀粉、輔美粉作為吸附劑和載體進(jìn)行噴霧干燥處理，控制噴霧的出風(fēng)溫度為75℃，試驗(yàn)中各載體添加量均為20%濃度，考察不同載體對(duì)抗菌肽噴霧干燥的保護(hù)作用。

1.6.2 載體添加量對(duì)噴霧干燥的影響 采用同一批發(fā)酵液作為噴霧料液，控制噴霧的出風(fēng)溫度為75℃，用輔美粉作為載體，添加量分別為5%、10%、15%、20%、25%進(jìn)行發(fā)酵液的噴霧干燥試驗(yàn)，取樣檢測噴霧粉的殺菌效價(jià)和水分含量，比較不同載體添加量對(duì)抗菌肽噴霧干燥的影響。

1.6.3 進(jìn)風(fēng)溫度對(duì)噴霧干燥的影響 采用同一批發(fā)酵液作為噴霧料液，控制一定的進(jìn)料流量，分 別 選 擇 進(jìn) 風(fēng) 溫 度 為 130、135、140、145、150、155℃，選用20%的輔美粉載體添加量，進(jìn)行發(fā)酵液的噴霧干燥試驗(yàn)，取樣檢測噴霧粉的殺菌效價(jià)和水分含量，比較不同進(jìn)風(fēng)溫度對(duì)抗菌肽噴霧干燥的影響。

1.6.4 出風(fēng)溫度對(duì)噴霧干燥的影響 采用同一批發(fā)酵液作為噴霧料液，調(diào)節(jié)進(jìn)風(fēng)溫度為135℃，選用20%的輔美粉載體添加量，分別選擇不同的出風(fēng)溫度為 60、65、70、75、80、85 ℃， 進(jìn)行發(fā)酵液的噴霧干燥試驗(yàn)，取樣檢測噴霧粉的殺菌效價(jià)和水分含量，比較不同出風(fēng)溫度對(duì)抗菌肽噴霧干燥的影響。

1.6.5 最佳噴霧工藝參數(shù)的正交試驗(yàn) 通過單因素試驗(yàn)考察保護(hù)劑種類和添加量、進(jìn)風(fēng)溫度、出風(fēng)溫度對(duì)抗菌肽噴霧干燥過程中殺菌效價(jià)和水分含量的影響，然后采用三因素三水平正交表試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以抗菌肽噴霧粉的殺菌效價(jià)和水分含量為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)確定不同噴霧工藝參數(shù)的最佳組合。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)的因素水平表

1.7 抗菌肽制劑質(zhì)量測定

1.7.1 殺菌效價(jià)測定 稱取1 g粉末溶解于9 mL pH 6.0的PBS緩沖液中，離心取上清，采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂孔穴擴(kuò)散法，參照梁潔等（2009）的方法。

1.7.2 水分含量測定 精確稱量1～3 g抗菌肽粉末制劑，放入鹵素水分測定儀中，記錄測量結(jié)果。

1.7.3 抗菌肽得率 計(jì)算公式如下：

抗菌肽得率/%=（干燥后每克粉末制劑殺菌效價(jià)×制劑總重量）/（干燥前發(fā)酵液每毫升殺菌效價(jià)×發(fā)酵液總體積）×100。

1.8 仔豬的生產(chǎn)性能測定 隨機(jī)選取60頭30日齡仔豬，大白×大長×杜絡(luò)克三元雜交豬，平均重約10 kg，從中挑選20頭體型外貌較差的作為弱仔組，其他40頭隨機(jī)分為兩組，分別為對(duì)照組和試驗(yàn)組，其中對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組飼喂含0.01%效價(jià)為10萬IU／g抗菌肽制劑的基礎(chǔ)日糧，弱仔組飼喂含0.02%的抗菌肽制劑的基礎(chǔ)日糧，對(duì)照組和試驗(yàn)組隨機(jī)分欄，每欄10頭，弱仔組單欄飼養(yǎng)，試驗(yàn)期30 d，試驗(yàn)開始前，對(duì)豬舍進(jìn)行徹底清潔消毒，仔豬自由采食飲水，按豬場常規(guī)飼養(yǎng)管理方式進(jìn)行。每天記錄各組進(jìn)食量，測定每頭豬的初始體重，結(jié)束體重，計(jì)算個(gè)體平均日增重和平均日采食量，并記錄觀察仔豬在試驗(yàn)期的健康狀況。

1.9 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，并采用T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，表中數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 保護(hù)劑的篩選 由表2可知，選用不同載體，抗菌肽的得率均在90%以上。選用麥芽糊精作為載體時(shí)抗菌肽得率最高，但是其噴霧粉的含水量也偏高，這可能因?yàn)辂溠亢珮O易吸水。麥芽糊精、水溶淀粉、輔美粉三種物料均可以作為抗菌肽的噴霧載體和吸附劑，但麥芽糊精和玉米淀粉屬于多糖類物質(zhì)，易吸水，水溶液比較黏稠，噴霧粉易貼壁，不易回收，而輔美粉價(jià)格較低，在保證產(chǎn)品得率的同時(shí)粉末含水量低，故后續(xù)試驗(yàn)以輔美粉作為噴霧載體。

表2 不同載體對(duì)噴霧干燥效果的影響 %

2.2 保護(hù)劑添加量對(duì)噴霧干燥的影響 保護(hù)劑在抗菌肽的噴霧干燥過程中，既可以作為吸附劑載體分散抗菌肽成分，又可以減少抗菌肽的高溫?fù)p失。從表3可看出，保護(hù)劑濃度越高，抗菌肽得率越高，損失越少，但載體濃度太高時(shí)，抗菌肽的效價(jià)均偏低，而且高壓泵的壓力會(huì)增高，會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)蛋白變性，而降低回收率，也會(huì)增加生產(chǎn)工作量和設(shè)備負(fù)擔(dān)?？咕乃趾縿t隨著保護(hù)劑濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，水分含量高不利于保存的穩(wěn)定性，根據(jù)噴霧粉質(zhì)量要求，抗菌肽發(fā)酵液選用20%載體添加量最合適。

表3 載體添加量對(duì)噴霧干燥效果的影響%

2.3 進(jìn)風(fēng)溫度對(duì)噴霧干燥的影響 從表4可看出，進(jìn)風(fēng)溫度越高，抗菌肽的得率和水分含量越低。當(dāng)進(jìn)料流量確定時(shí)，進(jìn)風(fēng)溫度越高，出風(fēng)溫度越高，共同影響著抗菌肽的得率和含水量。進(jìn)料流量提高，出風(fēng)溫度相應(yīng)降低，但進(jìn)料流量過大，會(huì)導(dǎo)致噴霧粉含水量增多，粉塵分散性差粒徑增大，極易貼壁，抗菌肽得率和保存穩(wěn)定性降低。綜合考慮，選擇進(jìn)風(fēng)溫度為135℃，此時(shí)抗菌肽的得率和含水量滿足制劑質(zhì)量要求。

表4 不同進(jìn)風(fēng)溫度對(duì)噴霧干燥效果的影響

2.4 出風(fēng)溫度對(duì)噴霧干燥的影響 噴霧干燥是將料液霧化成液滴后與熱空氣充分接觸在瞬間蒸發(fā)掉大部分水分。由于干燥時(shí)間極短大量水分蒸發(fā)吸熱使得粉粒溫度在極短時(shí)間內(nèi)急劇下降，若出風(fēng)溫度過高說明水分蒸發(fā)后粉粒的溫度仍處于高位，不利于細(xì)胞存活。而出風(fēng)溫度是由進(jìn)風(fēng)溫度和進(jìn)料流量決定的。從表5可看出，出風(fēng)溫度越高，抗菌肽的得率和含水量越低，當(dāng)出風(fēng)溫度高于80℃時(shí)抗菌肽的得率明顯降低。出風(fēng)溫度控制在75℃以下時(shí)產(chǎn)品活性損失較少。當(dāng)出風(fēng)溫度低于65℃時(shí)，噴霧粉的含水量偏高，單位時(shí)間內(nèi)的生產(chǎn)量較低，制備的抗菌肽制劑儲(chǔ)存期短，因此選用出風(fēng)溫度為75℃。

表5 不同出風(fēng)溫度對(duì)噴霧干燥效果的影響

2.5 噴霧干燥最佳工藝確定 從表6可知，出風(fēng)溫度、進(jìn)風(fēng)溫度、保護(hù)劑濃度對(duì)抗菌肽制劑的效價(jià)和含水量影響情況的顯著性排序是相同的，均為出風(fēng)溫度＞進(jìn)風(fēng)溫度＞保護(hù)劑含量?？咕牡寐实淖罴呀M合為A1B1C1，含水量的最佳組合為A3B3C2，考慮到出風(fēng)溫度和進(jìn)風(fēng)溫度對(duì)抗菌肽得率的影響更顯著，且抗菌肽得率這個(gè)指標(biāo)更重要，因此選擇A2B2水平。保護(hù)劑含量對(duì)兩個(gè)指標(biāo)的影響不顯著，保護(hù)劑濃度過高時(shí)，會(huì)加重設(shè)備負(fù)荷和高壓泵壓力，過低時(shí)抗菌肽得率降低，因此選擇C2水平。因此，本試驗(yàn)選擇的最優(yōu)組合為A2B2C2，即出風(fēng)溫度為75℃，進(jìn)風(fēng)溫度為135℃，保護(hù)劑濃度為20%，在此水平下，進(jìn)行3批次的噴霧干燥試驗(yàn)，抗菌肽得率的平均值為91.6%，含水量為3.94%，達(dá)到抗菌肽制劑的質(zhì)量要求。

2.6 抗菌肽制劑對(duì)仔豬生產(chǎn)性能的影響 從表7可看出，在試驗(yàn)期間，添加抗菌肽制劑的試驗(yàn)組與無添加對(duì)照組相比，日增重提高35.2%，料肉比降低25%，弱仔組的日增重雖然沒有明顯提高，但料肉比下降15.3%；試驗(yàn)組仔豬在試驗(yàn)期間，無腹瀉發(fā)生，殘次率降低63%，成活率提高8.3%，弱仔組殘次率與對(duì)照組相比，降低2%，但腹瀉和死亡情況并無改善。以上數(shù)據(jù)說明抗菌制劑可在飼料中不添加抗生素的前提下，提高斷奶仔豬的成活率，改善豬只腸道健康，降低料肉比和殘次發(fā)生率，減少仔豬腹瀉。

表6 抗菌肽制劑噴霧干燥的正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 抗菌肽飼料添加劑對(duì)仔豬生產(chǎn)性能的影響

3 結(jié)論與討論

本研究利用輔美粉作為保護(hù)劑，通過一系列優(yōu)化試驗(yàn)，運(yùn)用壓力噴霧干燥塔對(duì)產(chǎn)抗菌肽的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液進(jìn)行了噴霧干燥最佳工藝的研究，發(fā)現(xiàn)出風(fēng)溫度對(duì)抗菌肽效價(jià)有著顯著的影響，出風(fēng)溫度主要由進(jìn)風(fēng)溫度和進(jìn)料流量決定 （黃樂天等，2014）。當(dāng)出風(fēng)溫度高于80℃時(shí)，抗菌肽效價(jià)明顯降低。最終得到一組最佳噴霧干燥工藝：出風(fēng)溫度為75℃，進(jìn)風(fēng)溫度為135℃，保護(hù)劑輔美粉濃度為20%，在此工藝條件下，抗菌肽得率的平均值為91.6%，含水量為3.94%，符合抗菌肽制劑質(zhì)量要求。此工藝生產(chǎn)成本低，效率高，適合工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。

枯草芽孢桿菌已廣泛應(yīng)用于飼用微生態(tài)制劑的生產(chǎn)中，其在改善畜禽生產(chǎn)性能、維持腸道菌群平衡及提高消化率等方面均有較好的效果（李明華等，2014）。研究表明，單一微生態(tài)制劑存在著作用單一，質(zhì)量不穩(wěn)定，成本高，殺菌效果不如抗生素等缺陷（田木，2015），本研究枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生多種抗菌成分，尤其是抗革蘭氏陰性菌效果顯著。將枯草芽孢桿菌菌體和其代謝產(chǎn)物混合噴霧，在抗菌的同時(shí)也起到了調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡等作用。將所得的制劑作為飼料添加劑應(yīng)用于仔豬養(yǎng)殖試驗(yàn)，可提高仔豬的生長性能，降低腹瀉，提高其健康水平。本研究所得的抗菌肽枯草芽孢桿菌制劑可作為飼料添加劑應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖中，更多的動(dòng)物養(yǎng)殖應(yīng)用效果試驗(yàn)有待進(jìn)一步開展。

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