蔡迪鳴 張爽 劉艷杰

近年來, 隨著肝臟腫瘤的局部化療方法的快速發(fā)展, 很多肝動脈介入治療和門靜脈的化療等方式愈加普遍［1］, 阿霉素是一種較為常見的化療藥物, 臨床有效的應(yīng)用在各類腫瘤的治療之中, 但是其濃度過高會產(chǎn)生生物毒性, 影響骨髓造血功能, 嚴(yán)重時導(dǎo)致心力衰竭、心肺功能損害等［2］。本文旨在發(fā)現(xiàn)一種能夠較為準(zhǔn)確測定血漿和肝組織中阿霉素濃度的方式。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇成年大鼠30只, 雌雄不拘, 體重350 g左右。主要試劑有阿霉素(Doxorubicin, DOX)標(biāo)準(zhǔn)品, 100 mg, 中國藥品生物制品會監(jiān)制；柔紅霉素(Daunorubicin, DAM)標(biāo)準(zhǔn)品,100 mg, 中國藥品生物制品會監(jiān)制［3］。主要應(yīng)用儀器為美國惠普公司生產(chǎn)的HP100型高效液相色譜儀, HPLC色譜柱,美國惠普公司熒光檢測器。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 首先, 使用HPLC不銹鋼色譜柱進行試驗, 其中有流動的配管, 超純水, 0.1 mol/L的磷酸, 三乙酸等,將水相和乙酸等繼續(xù)充分混合, 保證HCl的pH數(shù)值調(diào)節(jié)到2.8左右, 將流速設(shè)定為1.6 ml/min并使用熒光檢測激發(fā)光和吸收光的具體波長, 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為：柔紅霉素, 標(biāo)本進樣量：保證在 50 μl左右。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備 設(shè)置鹽酸阿霉素儲備液并精密稱取25 mg的鹽酸阿霉素, 將其與25 ml甲醇混合溶解之后配母液,在隱蔽處儲存于25 ml保存瓶之中, 制定柔紅霉素的貯備液,精密化取用25 ml柔紅霉素, 并將其與甲醇溶解后避光儲存在25 ml的保存瓶之中, 進行備用。

1.2.3 標(biāo)本處理 對大鼠進行阿霉素注射, 并獲取大鼠下腔部位靜脈血共計3 ml, 獲取大鼠的肝臟組織共計0.5 g, 并在冰箱中儲存, 進行血漿標(biāo)本的有效處理, 其中吸取500 μl的血漿, 將其放置在20 ml的離心管中進行離心操作, 并適當(dāng)加入100 μl工作濃度的柔紅霉素制成內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液, 加入100 μl的0.2 M氯化鈣溶液進行靜置處理［4］, 并使用pH為9.0的硼醋酸與其融合之后加入氯仿等提取液, 除去上層的水相, 加入200 μl的磷酸, 并使用旋渦混勻器進行混合處理, 離心5 min之后去上層水相。將0.5 g肝組織放入1 ml的生理鹽水中進行處理, 其中內(nèi)標(biāo)為100 μl的柔紅霉素, 搖勻5 min后使用超生勻漿處理2 min。加投入8 ml氯仿等提取液,離心處理5 min后, 獲得上層清液待測。

1.2.4 檢測標(biāo)準(zhǔn) 將阿霉素的溶液分別制成5、10、25、250、500、1000 μg/ml等濃度的溶液, 并將上述的溶液分別與肝部組織的柔紅霉素和空白血漿進行標(biāo)本處理, 將阿霉素峰面積和柔紅霉素峰面積的比值與具體的濃度進行比較。

2 結(jié)果

按照上述檢測方法得到色譜分析圖, 將阿霉素峰面積和柔紅霉素峰面積的比值為縱坐標(biāo), 濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 血漿線性回歸方程為：ADOX/ADAM=0.0201X+0.1105, 血漿最小檢測濃度為6 ng/ml, 對于其濃度變化, 在6～1000 ng/ml中變化較好。肝臟組織線性回歸方程為：ADOX/ADAM=0.0198X-0.9855, 肝臟最小檢測濃度為26 ng/ml, 其應(yīng)用范圍為26～2000 ng/ml之間, 線性關(guān)系表現(xiàn)較好。見圖1。

圖1 阿霉素與柔紅霉素峰面積關(guān)系圖

3 討論

阿霉素屬于蒽環(huán)類抗腫瘤藥物, 在乳腺癌、胃癌、肺癌等癌癥中應(yīng)用較為頻繁, 在化療過程中, 阿霉素可以有效的抑制患者體內(nèi)DNA和RNA的合成, 其中對于RNA的合成抑制作用更加顯著, 阿霉素作用效果相對較好, 屬于周期非特異性藥物［5-7］。其能夠快速殺滅周期中的各類腫瘤細(xì)胞,對于急性白血病, 如急性淋巴細(xì)胞白血病、粒細(xì)胞白血病等效果良好, 其同時可以與其他的抗癌藥物進行搭配使用, 但是該種藥物擁有較強的副作用［8,9］, 臨床對其濃度進行全面有效的檢測, 現(xiàn)階段, 反相高效液相色譜法已經(jīng)建立, 并成為了藥物濃度檢測的重要方法, 得到了臨床的廣泛使用, 當(dāng)前的研究中, 對于血漿和唾液中的阿霉素研究數(shù)量一般較多,但是對于組織內(nèi)部阿霉素濃度的研究內(nèi)容相對較少。

本次實驗中, 首先需要將阿霉素從肝組織中成功釋放出來, 可以使用組織的勻漿處理誘導(dǎo)肝細(xì)胞的破裂, 適當(dāng)釋放阿霉素, 對于阿霉素來說, 氯仿等生物有機溶劑屬于相對較好的提取溶劑, 能夠?qū)⒚顾貜膭驖{液中完成有效的提取到有機溶劑中, 使用氮氣的方式進行吹干操作后, 仍然需要進行有機物的溶解操作, 檢測到的藥物物質(zhì)將會更加集中化,檢測值顯著降低, 對檢測的精度有著較好的提高作用, 但是以上的勻漿方式不能誘導(dǎo)肝細(xì)胞的破裂, 很多阿霉素?zé)o法從肝細(xì)胞中較好的釋放出來, 很多藥物不能直接通過萃取過程轉(zhuǎn)移到有機溶劑之中, 因此, 對于肝臟的檢測限度值一般高于血漿的檢測限度值。

在本次的研究中, 首先進行勻漿處理, 其次沉淀蛋白質(zhì),萃取, 有機復(fù)溶等, 最終有效的測定了血漿和肝部組織中的阿霉素濃度, 為阿霉素的濃度測定和后續(xù)的藥物質(zhì)量研究有著較好的作用。

綜上所述, 反相高效液相色譜熒光檢測法能夠較好地測定血漿和肝臟組織內(nèi)阿霉素的藥物濃度, 其操作的靈敏度相對較高, 且較為簡單, 穩(wěn)定性強。

［1］ 符繼紅, 褚金芳 , 王吉德, 等.固相萃取反相高效液相色譜熒光檢測法測定擬南芥中的生長素.分析化學(xué), 2009, 37(9):1324-1327.

［2］ 潘義勤, 潘秀萍, 潘繼剛.反相高效液相色譜-熒光檢測法測定粉針劑中帕米膦酸二鈉含量及有關(guān)物質(zhì).中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測, 2008, 5(1):29-31.

［3］ 張宏文, 錢立新, 王蔚青, 等.反相高效液相色譜熒光檢測法測定血漿及膀胱中阿霉素的濃度.藥學(xué)與臨床研究, 2006, 14(1):4-6.

［4］ 姚藍(lán), 徐和新 , 苗積康, 等 .反相高效液相色譜-熒光檢測法測定血漿中拉貝洛爾的含量.中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測, 2005, 2(3):18-20.

［5］ 秦永平, 鄒遠(yuǎn)高, 梁茂植, 等.柱切換-熒光檢測反相高效液相色譜法測定血漿中特布他林濃度.分析化學(xué), 2004, 32(9):1216-1218.

［6］ 傅承光, 徐宏達.反相高效液相色譜法柱后調(diào)節(jié)PH膠束增敏熒光檢測四環(huán)素類藥物的研究.色譜, 1995(5):365-367.

［7］ 何素梅, 魏樹禮, 吳傳斌, 等.反相高效液相色譜熒光檢測法測定血漿或肝組織中阿霉素含量.藥物分析雜志, 1994(4):8-11.

［8］ 張志友, 張文怡, 李宏偉, 等.反相高效液相色譜法檢測組織中阿霉素含量的實驗研究.武警后勤學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2000(1):37-40.

［9］ 呂興萍, 童姍姍.反相高效液相色譜熒光檢測法測定血漿中阿霉素的濃度.安徽科技學(xué)院學(xué)報, 2008, 22(5):31-35.