陳貴宇，潘煜辰，李清清，冷桃花*，李君績(jī)，葛 宇

硒是一種人體必需的微量元素[1]。硒具有抗癌及抗衰老作用，能夠增強(qiáng)人體免疫力，調(diào)節(jié)人體維生素的吸收與利用，維持人體健康狀態(tài)[2]。硒攝入不足容易引起人體免疫力下降，導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，比如近視、白內(nèi)障、肝癌、肺癌、白血病等[3]。硒的日攝入量至少需要維持30～40 μg，但也不是越多越好，日攝入量達(dá)到400 μg也會(huì)導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，比如頭發(fā)脫落、指甲變脆易脫落、神經(jīng)系統(tǒng)異常等，引起人體代謝功能紊亂[4]。

我國(guó)很多地方都屬于缺硒地區(qū)，因硒缺少引起的地方病波及東北到西南的十多個(gè)省和自治區(qū)，所引發(fā)的疾病包括已發(fā)現(xiàn)的克山病和大骨節(jié)病等。日常人體硒的攝入主要來(lái)源于食物。動(dòng)物內(nèi)臟、水產(chǎn)品、蛋類等都是硒含量較高的食物；豆類、肉類蔬菜以及糧食也有少量的硒存在[5]。針對(duì)部分嚴(yán)重硒缺乏地區(qū)，一些富硒食品如富硒大米、富硒大豆、富硒雞蛋等也被研發(fā)出來(lái)，用于補(bǔ)充缺硒人群對(duì)硒的正常攝入，維持身體健康。

硒對(duì)人體的作用取決于硒的形態(tài)，人體對(duì)不同形態(tài)的硒吸收和利用都不同。硒存在的形態(tài)有很多種，比較常見的有硒酸根（Se（VI））、亞硒酸根（Se（IV））、硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基-硒代半胱氨酸（SeMC）、硒代蛋氨酸（SeMet）等。針對(duì)這些不同形態(tài)的硒化合物，也出現(xiàn)了許多相應(yīng)的檢測(cè)分析方法[6-10]，分離硒化合物通常采用氣相色譜法[11]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[12]、離子色譜法[13]以及毛細(xì)管電泳法[14]，檢測(cè)方法有原子吸收光譜法[15]、原子熒光光譜法[16]、電感耦合等離子發(fā)射光譜法[17]、電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）法[18-28]。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC與ICP-MS聯(lián)用方法對(duì)5 種常見硒化合物進(jìn)行分離檢測(cè)，該聯(lián)用技術(shù)具有分離效率高、檢出限低、精密度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于這5 種硒化合物的分離和檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SeCys2溶液（44.2 μg/g）、SeMC溶液（34.8 μg/g）、Se（IV）溶液（42.9 μg/g）、SeMet溶液（39.4 μg/g）、Se（VI）溶液（41.5 μg/g）（均以硒計(jì)） 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；檸檬酸（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為優(yōu)級(jí)純；超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm） 美國(guó)Millipore公司；ICP-MS 7500cs調(diào)諧溶液（1 μg/L，Li、Mg、Y、Co、Tl、Co） 美國(guó)Agilent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7500型ICP-MS儀、1200 series型HPLC儀 美國(guó)Agilent公司；Hamilton PRP-X100（250 mm×4.1 mm，10 μm）色譜柱 瑞士Hamilton公司；AL204型萬(wàn)分位電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；4-16K離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；超聲波清洗儀 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 儀器工作參數(shù)

色譜分離條件：PRP-X100（250 mm×4.1 mm，10 μm）色譜柱；流動(dòng)相A：10 mmol/L檸檬酸溶液；流動(dòng)相B：超純水；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。洗脫梯度見表1。

表1 HPLC梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of HPLC

ICP-MS工作條件：射頻功率1 500 W；霧化室溫度2 ℃；載氣流量0.5 L/min；輔助氣流量0.1 L/min；采樣模式：時(shí)間積分；分析時(shí)間1 200 s。樣品分析前用ICP-MS調(diào)諧液將儀器靈敏度調(diào)至最佳。

1.3.2 樣品前處理

稱取約0.2 g茶葉樣品于10 mL離心管中，加入1 mL 10 mg/mL的蛋白酶K溶液，加純水定容到10 mL，超聲1 h，10 000 r/min離心15 min，取上層清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

圖1 流動(dòng)相為100% A時(shí)硒化合物分離譜圖Fig. 1 Chromatograms of selenium species with 100% mobile phase A

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)[29]報(bào)道，選用檸檬酸溶液為流動(dòng)相，通過(guò)優(yōu)化檸檬酸溶液的濃度確定最佳色譜分離條件。根據(jù)文獻(xiàn)[30]，如圖1a所示，10 mmol/L的檸檬酸溶液（pH 5.5）單一等度洗脫能較好的分離SeCys2、Se（IV）、SeMet、Se（VI）這4 種硒形態(tài)化合物，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。但SeMC與Se（IV）在該流動(dòng)相中卻無(wú)法分離（圖1b）。

圖2 不同比例流動(dòng)相硒化合物分離譜圖Fig. 2 Chromatograms of selenium species with different mobile phase compositions

為了使得SeMC和Se（IV）兩種硒形態(tài)化合物能夠取得較好的分離度，以達(dá)到完全分離，本研究對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。以檸檬酸溶液（流動(dòng)相A）-水（流動(dòng)相B）進(jìn)行色譜分離條件的摸索，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相A和B的比例，來(lái)實(shí)現(xiàn)SeMC和Se（IV）較好的分離，實(shí)驗(yàn)分別研究了流動(dòng)相A為100%、50%、10%、5%時(shí)兩種硒化合物的分離情況如圖2所示，最終發(fā)現(xiàn)在含5%的流動(dòng)相A時(shí)，SeMC和Se（IV）兩種硒形態(tài)化合物可以完全分離。

圖3 硒化合物分離譜圖Fig. 3 Chromatograms of selenium species with isocratic and gradient elution

當(dāng)流動(dòng)相A-B（5∶95，V/V）時(shí)，5 種硒形態(tài)化合物得到了較好的分離，整個(gè)分離時(shí)間達(dá)到25 min左右（圖3a）。由于Se（VI）的分離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不但導(dǎo)致峰形變寬，而且導(dǎo)致分析成本增加，不利于實(shí)際樣品的快速檢測(cè)。由圖3a可知，SeCys2、SeMC、Se（IV）、SeMet在7 min內(nèi)能夠全部分離，而 Se（VI）則在22 min左右出峰，因此，本研究考慮采用梯度洗脫，縮短Se（VI）的分離時(shí)間且不影響前面4 種硒形態(tài)化合物的分離度。研究表明，隨著流動(dòng)相中檸檬酸溶液比例的增加，Se（VI）的出峰時(shí)間逐漸縮短。隨著檸檬酸濃度的增大，鹽含量高不利于ICP-MS的儀器保養(yǎng)，所以本研究綜合考慮采用了如表1所示的洗脫梯度，5 種硒形態(tài)化合物在較短的時(shí)間內(nèi)全部得到了完全分離（圖3b），又能較好地保護(hù)儀器。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

針對(duì)硒形態(tài)化合物的提取試劑常見的有水、鹽酸浸提和蛋白酶酶解等。本研究分別考察了以水、1%硝酸以及蛋白酶K溶液作為提取試劑對(duì)富硒茶葉中硒形態(tài)化合物的提取效果。結(jié)果表明，用水和1%硝酸溶液提取的溶液中未檢測(cè)到硒形態(tài)化合物，蛋白酶K溶液中有硒形態(tài)化合物檢出，這可能因?yàn)楦晃枞~中的硒形態(tài)化合物主要以硒蛋白和硒糖的形式存在，在水或1%硝酸溶液中溶解性較差，這一結(jié)果與文獻(xiàn)[30]報(bào)道相符。因此本研究采用蛋白酶K溶液作為提取試劑。確定好提取液后，比較了恒溫振蕩與超聲提取兩種提取方式的提取效率，結(jié)果通過(guò)超聲提取可以大大縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提取效果良好。最后，又進(jìn)一步優(yōu)化了超聲提取時(shí)間以及蛋白酶K用量。

2.2.1 超聲時(shí)間的選擇

采用1.3.1節(jié)前處理方法，研究了超聲時(shí)間對(duì)SeMC提取量的影響。結(jié)果表明，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，SeMC提取量增加，在60 min后增加量趨于平緩（圖4）。因此，本實(shí)驗(yàn)選取超聲60 min為最佳提取條件。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)提取效率的影響Fig. 4 Effect of ultrasonic treatment time on extraction efficiency

2.2.2 蛋白酶K用量的選擇

圖5 蛋白酶K用量對(duì)提取效率的影響Fig. 5 Effect of protease dosage on extraction efficiency

采用1.3.1節(jié)前處理方法，研究了蛋白酶K用量對(duì)SeMC提取量的影響，如圖5所示，結(jié)果表明，SeMC的提取量隨蛋白酶K用量的增加而增加，在用量為1 mL以上時(shí)增加量趨于平緩。因此，本實(shí)驗(yàn)選取蛋白酶K用量1 mL為最佳提取條件。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限結(jié)果

配制質(zhì)量濃度分別為0、5、10、20、30、40、50 μg/L的一系列5 種硒化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下考察方法的線性范圍，5 種硒化合物在0～50 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好（表2），線性相關(guān)系數(shù)R2不小于0.999 8。

表2 5 種硒化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性參數(shù)及檢出限Table 2 Linear correlation coefficients and detection limits of 5 selenium species

在空白樣品中加入5 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3 倍基線噪音測(cè)定5 種硒化合物的檢出限分別為SeCys20.13 μg/L、SeMC 0.25 μg/L、Se（IV）0.24 μg/L、SeMet 0.65 μg/L、Se（VI）1.09 μg/L。

分別向樣品中加入5、25、50 μg/L 3 個(gè)水平的5 種硒化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，各平行處理6 個(gè)樣品，經(jīng)扣除樣品空白后，5 種硒化合物的回收率在91.8%～109.4%之間，5 種硒化合物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在5%以內(nèi)。

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用本研究?jī)?yōu)化的方法對(duì)富硒茶葉（產(chǎn)地為恩施，品種為綠茶）樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果檢測(cè)出了SeMC和SeMet，如圖6所示，其中，SeMC含量為0.27 mg/kg，SeMet為0.066 mg/kg。

圖6 實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果Fig. 6 Chromatogram of real sample

3 結(jié) 論

采用HPLC-ICP-MS測(cè)定富硒茶葉中5 種硒化合物，通過(guò)對(duì)色譜分離條件和樣品前處理方法的優(yōu)化，利用高效液相色譜Hamilton PRP-X100色譜柱分析5 種硒化合物，線性范圍為0～50 μg/L，線性相關(guān)系數(shù)不小于0.999 8，檢出限為0.13～1.09 μg/L，5 種硒化合物的回收率在91.8%～109.4%之間，5 種硒化合物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在5%以內(nèi)。本方法樣品前處理簡(jiǎn)便快速、檢出限低、精密度高、重復(fù)性好，能有效地同時(shí)處理和分析5 種硒化合物，適用于富硒茶葉中5 種硒化合物的測(cè)定。

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