王國(guó)林，　達(dá)熱卓瑪， 徐德平*

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

羅馬洋甘菊（Anthemis nobilis L.），菊科黃春菊屬一年生或多年生草本植物，廣布于南歐和西歐，目前在我國(guó)新疆也有種植。羅馬洋甘菊（以下簡(jiǎn)稱洋甘菊）有極強(qiáng)的香味，在醫(yī)藥、香料和化妝品的生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng)用。洋甘菊水提物在降低STZ糖尿病大鼠的血糖含量中有顯著效果[1]，洋甘菊精油能減緩經(jīng)期綜合癥[2]，幫助肝臟再生和解痙等。另外，洋甘菊精油還可以作為香薰按摩和護(hù)發(fā)產(chǎn)品中的成分[3-4]。在化妝品中添加洋甘菊可以使皮膚更加舒緩和柔滑[5-6]，但對(duì)其在美白方面的研究還未見報(bào)道。

為此，本文對(duì)洋甘菊提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用進(jìn)行了研究，旨在明確洋甘菊乙醇提取物中的起美白作用的物質(zhì)，為洋甘菊在美白方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

羅馬洋甘菊，購(gòu)于新疆伊犁；L-酪氨酸 （生化級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉皆為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；酪氨酸酶（生化級(jí)），上海寶曼生物科技有限公司產(chǎn)品。 MCI CHP20P（75～150 μm）柱填料，Mitsubishi Kasei Co. 產(chǎn)品；ODS 柱填料，Nacalai Tosoh Inc產(chǎn)品。

1.2　儀器與設(shè)備

RAT-100型萃取罐，無(wú)錫申科儀器有限公司產(chǎn)品；R-1002型旋轉(zhuǎn)儀，上海申順生物科技有限公司產(chǎn)品；ZF-90型暗箱式紫外透射儀，上海顧村電光儀器廠制造；WFJ 2000型可見分光光度計(jì)，優(yōu)尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；核磁共振儀Avance 500 MHz，Bruer公司產(chǎn)品。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1洋甘菊醇提物的制備洋甘菊經(jīng)水蒸汽蒸餾法去除揮發(fā)性成分后得到的殘?jiān)?，按料液質(zhì)量比1∶5加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，于50℃條件下攪拌提取3 h，過(guò)濾取上清液，如此重復(fù)2次。將3次所得上清液減壓濃縮去乙醇后即得洋甘菊醇提物濃縮液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2洋甘菊醇提物的粗分離將2.1所得洋甘菊提取物解凍后，用去離子水作適當(dāng)稀釋，過(guò)慮后將濾液上MCI柱（5 cm×100 cm），依次用去離子水和不同體積分?jǐn)?shù)乙醇以15 mL/min流速進(jìn)行梯度洗脫。TCL檢測(cè)，茴香醛-硫酸顯色，將洗脫液分成A（水洗脫）、B（15%洗脫）、C（30%洗脫）、D（70%洗脫）4 個(gè)部分所得洗脫物分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。分別減壓濃縮并真空干燥后，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3洋甘菊醇提物對(duì)酪氨酸酶抑制作用的研究

1）試劑的配制

①緩沖溶液 （PBS）的配制準(zhǔn)確稱取Na2HPO43.55 g，NaH2PO4·2H2O 3.9 g， 分別用去離子水溶解后混合，定容至1 000 mL，調(diào)pH至6.8，配成25 mmol/L的緩沖溶液，置于4℃冰箱中待用。

②1 mmol/L酪氨酸溶液的配制準(zhǔn)確稱取L-酪氨酸181 mg，加入數(shù)滴0.1 mol/L鹽酸溶解后，加約95 mL磷酸緩沖溶液，調(diào)節(jié)其pH至6.8，然后定容至100 mL。置于4℃冰箱中待用。

③酪氨酸酶溶液的配制將酪氨酸酶用已配好的磷酸緩沖液溶解分裝于PE管，置于-20℃冰箱中保存。

④樣品的配制準(zhǔn)確稱取120 mg 1.3.1所得樣品和1.3.2所得的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4個(gè)樣品，2.1所得樣品用含體積分?jǐn)?shù)10%DMSO、pH為6.8的PBS溶解，2.2所得4個(gè)樣品用PBS溶解，均配制成8 mg/mL的溶液備用。

2）洋甘菊乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的測(cè)定酪氨酸酶抑制率的測(cè)定參考任紅榮[7]的方法并稍加改動(dòng)。 按表 1 準(zhǔn)確吸取 T1、T2、C1、C24 組反應(yīng)液，在37℃的水浴中恒溫20 min后，各加入240 μL酪氨酸酶溶液，充分混勻，反應(yīng)30 min后，迅速冷卻以減慢反應(yīng)，然后移入比色皿中，于475 nm處測(cè)吸光度AT1、AT2、AC1、AC2，按公式 1 求抑制率。

表1　反應(yīng)液組成與體積Table 1　Composition and volume of the reaction solution

3）不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物對(duì)酪氨酸酶抑制率的測(cè)定根據(jù)1.3.3中2）的方法，在反應(yīng)體系中分別加不同質(zhì)量濃度的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4個(gè)樣品，測(cè)定各部分對(duì)酪氨酸酶的抑制率。

1.3.4洋甘菊醇提物MCI 30%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇洗脫物的分離純化將30%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇洗脫物用適量的去離子水溶解后，過(guò)MCI柱（5 cm×100 cm），用30%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇洗脫，將洗脫液分成A、B、C 3個(gè)部分。分別將各部分依次過(guò)MCI（3 cm×100 cm）柱和ODS-A柱（3 cm×100 cm），經(jīng)TCL鑒定純度，共得 3個(gè)純化合物 1、2、3。

2　結(jié)果與分析

表2　不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用Table 2　Inhibition of tyrosinase activity by different ethanol concentration elution

2.1　洋甘菊乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的測(cè)定

對(duì)洋甘菊體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率如圖1。

圖1　乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制Fig.1　Inhibition of tyrosinase by crude ethanol extract

從圖可知，洋甘菊體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提物對(duì)酪氨酸酶的活性有抑制作用，并且在提取物質(zhì)量濃度小于200 μg/mL時(shí)，抑制率隨著質(zhì)量濃度的增加而增加較快；當(dāng)提取物質(zhì)量濃度大于200 μg/mL時(shí)，抑制率隨著質(zhì)量濃度的增加而較慢。

2.2　不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用

對(duì)洋甘菊醇提物經(jīng)MCI柱后不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率如表2所示。

由表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫中，30%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇濃度洗脫物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率最靈敏，并且隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，抑制率趨于平衡。而水洗物和體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗脫物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率都較低。因此，本文針對(duì)洋甘菊乙醇粗提物的30%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇洗脫物部位進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化研究。

2.3　30%體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物的分離

對(duì)30%體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物經(jīng)反復(fù)上MCI柱和ODS-A柱后，TCL檢測(cè)，茴香醛-硫酸顯色，得到3個(gè)單體化合物。

2.4　活性物質(zhì)的確定

以二甲亞砜為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)物，將上述3個(gè)化合物經(jīng)氫譜和碳譜等光譜數(shù)據(jù)分析，確定其結(jié)構(gòu)。

1）化合物1,淡黃色粉狀物，易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，可溶于水。

表3　化合物1、2、3的13C-NMR數(shù)據(jù)Table 3　Signals of carbon in the13C-NMR 0f 1，2 and 3

由化合物1的1H-NMR譜圖可知，δ 8.06處有2個(gè)質(zhì)子信號(hào)，J=8.9 Hz，δ 6.88有2個(gè)質(zhì)子信號(hào)，J=8.9 Hz，說(shuō)明該化合物中含有1個(gè)對(duì)位取代苯環(huán)，這4 個(gè)氫均為苯環(huán)上的氫。δ 6.44（1H，d，J=2.0），δ 6.21（1H，d，J=2.0）為苯環(huán)上的間位質(zhì)子信號(hào)，是連有羥基的碳鄰位碳上的氫。δ 5.46處的質(zhì)子信號(hào)為糖的端基質(zhì)子，J=7.1，可知該糖為β構(gòu)型。δ 3.33～δ 4.95處的質(zhì)子信號(hào)為糖上的其他氫?；衔?的13CNMR數(shù)據(jù)如表3所示，經(jīng)與文獻(xiàn)[9]相比較，可判斷該化合物為山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。其結(jié)構(gòu)見圖2左上。

2）化合物2，淡黃色粉狀物，易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，可溶于水。

從化合物2的1H-NMR譜可見，δ 6.20，δ 6.40（1H，d，J=2.0）處各有 1個(gè)質(zhì)子，為苯環(huán)上的間位氫。δ 6.86，δ 7.57，δ 7.59 處各有 1 個(gè)質(zhì)子信號(hào)，從偶合常來(lái)看是同一個(gè)苯環(huán)的3個(gè)氫。δ 5.47（H，d，J=7.0 Hz）處為葡萄糖端基質(zhì)子信號(hào)，δ 3.45～δ 3.59為糖上的其他質(zhì)子信號(hào)?；衔?的13C-NMR數(shù)據(jù)表如表3所示，化合物2中有21個(gè)碳，其中6個(gè)碳為糖中的碳，一個(gè)為甲氧基。將其余15個(gè)碳的碳信號(hào)與文獻(xiàn)[10]參比，可知化合物2為應(yīng)為異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。其結(jié)構(gòu)見圖2右上。

3）化合物3，淡黃色粉狀物，易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，可溶于水。從1H-NMR、13C-NMR譜中可見，化合物3與化合物1的母環(huán)結(jié)構(gòu)一樣，2、但不同之處為化合物3糖C6位連有一個(gè)3-羥基-3-甲基-戊二?；鶊F(tuán)。黃酮上連有3-羥基-3-甲基-戊二?；鶊F(tuán)可能是乙酰輔酶A或L-亮氨酸在洋甘菊代謝合成異戊烯二磷酸過(guò)程中的中間產(chǎn)物。GABRIELA M.等人[10]在1996年就從洋甘菊水提物中分離并解出該化合物。該化合物在洋甘菊中含量較少。其結(jié)構(gòu)見圖2下。

3　結(jié)　語(yǔ)

研究發(fā)現(xiàn)，洋甘菊體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶的活性有抑制作用，并且經(jīng)MCI柱后30%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇洗脫物對(duì)酪氨酸酶的抑制最靈敏。從30%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇洗脫物中分離得到3個(gè)化合物，經(jīng)NMR鑒定為山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3-O-（6"-3-羥基-3-甲基-戊二?；?β-D-吡喃葡萄糖苷，都是黃酮類化合物。由此可以推測(cè)對(duì)酪氨酸酶的活性有抑制作用的成分應(yīng)是黃酮類，這與文獻(xiàn)[11]中報(bào)道甘草中胱甘草腚（黃酮類物質(zhì)）對(duì)酪氨酸酶有強(qiáng)抑制作用的報(bào)道相類似。因此，本研究確定了洋甘菊美白作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，為洋甘菊美白護(hù)膚品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]EDDOUKS M.Potent hypoglycaemic activity of the aqueous extract of Chamaemelum nobile in normal and streptozotocininduced diabetic rats[J].Diabetes Research and Clinical Practice，2005，67：189-195.

[2]OWLIAP，RASOOLI I，SADEFI H.Antistreptococcal and antioxidant activity of essential oil from Matricaria chamomilla L.research[J].Journal of Biological Sciences，2007，2（2）：155-160.

[3]ANDERSON C，LIS-BALCHIN M，et al.Evaluation of massage with essential oils on childhood atopic eczema[J].Phytother Res，2000，14：452-456.

[4]WILKINSON S，ALDRIDGE J.An evaluation of aromatherapy massage in palliative care[J].Palliat Med，1999，13：409-417.

[5]SCALA G.Acute，short-lasting rhinitis due to chamomile-scented toilet paper in patients allergic to Compositae[J].Int Arch Allergy Immunol，2006，139：330-333.

[6]THORNFELDT C.Cosmeceuticals containing herbs：fact，fiction，and future[J].Dermatol Surg，2005，7：873-880.

[7]REN Hongrong，ZHANG Weiming，SHAN Chengying，et al.Study on inhibition of ethanol extract from nymphaea hybrid on the activity of tyrosinase[J].Detergent ＆ Cosmetics，2009，32（12）：19-21.（in Chinese）

[8]孫文基.天然藥物成分NMR譜模擬特征及實(shí)例[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2009：78.

[9]惠永正.中藥天然產(chǎn)物大全[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2011：2906.

[10]LUO Congyan，MU Chunhai，WANG Yuanji，et al.The isolation of glabridin and inhibitory effect on activity of tyrosinase[J].Journal of Shihezi University（Natural Science），2010，48（4）：479-481.（in Chinese）