楊淑嬌,楊永平,石玲玲,畢迎鳳,李建文,楊錦超,楊雪飛,*

1 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所中國(guó)西南野生生物種質(zhì)資源庫(kù),昆明 650201 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049 3 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所資源植物與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650201 4 西南林業(yè)大學(xué), 昆明 655024

外生菌根(Ectomycorrhiza,ECM)是由土壤真菌與植物根系形成的互惠共生體[1-2],是森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,在維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和多樣性等方面發(fā)揮著重要作用[3]。松口蘑(Tricholomamatsutake),又名松茸,是一種北半球廣布的典型ECM真菌,主要與松科和殼斗科多種植物共生形成外生菌根,包括日本的赤松(Pinusdensiflora)、偃松(Pinuspumila)、南日本鐵杉(Tsugasiebordii)[4- 10],芬蘭的歐洲赤松(Pinussylvestris)、歐洲云杉(Piceaabies)[11],以及中國(guó)的高山松(Pinusdensata)、云南松(Pinusyunnanensis)、高山櫟(Quercussemecarpifolia)和元江錐(Castanopsisorthacantha)等[12, 13]。最新研究還發(fā)現(xiàn),松茸能被成功接種到其他科屬的根系,在試驗(yàn)條件下產(chǎn)生共生關(guān)系甚至形成菌塘結(jié)構(gòu),例如,薔薇科的Prunusspeciosa[14]、樺木科的Betulaplatyphyllavar. japonica[15]以及楝科的Cedrelaherrerae[16]。這充分說(shuō)明松茸宿主植物的多樣性和廣譜性。

松茸子實(shí)體是名貴的野生食用菌,主要出口日本,在當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)上價(jià)格高達(dá)1000美元/kg[17]。以日本學(xué)者為主的科學(xué)家對(duì)松茸的人工栽培進(jìn)行了近百年的探索[10-11, 18-19],取得一定成果。目前能實(shí)現(xiàn)菌根合成并生成一定的菌塘結(jié)構(gòu),但尚未完全實(shí)現(xiàn)人工栽培出菇[20-21]。究其原因,一方面是我們對(duì)松茸與其宿主植物之間的相互關(guān)系和作用機(jī)制的了解不全面；另一方面,對(duì)松茸菌塘及其內(nèi)的微生物群落特征了解較少。

菌塘(Shiro)是由松茸的地下菌絲、宿主根系及周圍的土壤結(jié)合形成的白色海綿狀結(jié)構(gòu)[4],是松茸生長(zhǎng)的重要載體和完成主要生活史的具體場(chǎng)所[22]。關(guān)于松茸菌塘內(nèi)的微生物,前人已做了一些探討[23- 26],研究結(jié)果的廣度和深度隨著技術(shù)的發(fā)展不斷提高。日本學(xué)者Ohara等人早在1967年便采用分離培養(yǎng)的方式發(fā)現(xiàn)菌塘中可培養(yǎng)的細(xì)菌和放線菌減少[23]。隨著技術(shù)的發(fā)展,Lian[24]、Kataoka[25]、Vaario[26]、馬大龍[27]等人分別通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定、ITS(Internal transcribed spacer,ITS)多態(tài)性分析、PCR-變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技術(shù)、磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid,PLFA)生物標(biāo)記法等手段對(duì)松茸菌塘土壤微生物群落特征進(jìn)行了深入研究。近年來(lái),由于新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,宏基因組學(xué)方法也運(yùn)用到松茸菌塘的研究中來(lái)[28-29]。盡管如此,前人對(duì)松茸菌塘微生物的研究只針對(duì)松科某一種宿主森林類型,如Ogawa[4, 7- 9],Lian[24],Ohara[23],Kataoka[25]和Kim[28-29]等人的研究,尚未見殼斗科宿主森林菌塘內(nèi)微生物群落的研究報(bào)道。除此之外,還未見不同宿主森林類型內(nèi)松茸菌塘微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的對(duì)比分析,缺乏對(duì)規(guī)律性的認(rèn)知。

本研究以松茸典型產(chǎn)區(qū)云南省迪慶州香格里拉縣分布的高山櫟林和高山松林為研究對(duì)象,采用磷脂脂肪酸(PLFA)生物標(biāo)記法[30]對(duì)比研究上述兩種松茸宿主森林類型內(nèi)的菌塘和非菌塘的土壤微生物群落特征,分析與其相關(guān)的土壤化學(xué)性質(zhì)。目的是回答松茸菌塘微生物群落特征在不同林型間是否存在異同的科學(xué)問(wèn)題,為科學(xué)管理具有高附加值的松茸資源,保障其產(chǎn)量和質(zhì)量,以及探索人工栽培條件奠定研究基礎(chǔ)。

1 研究地區(qū)與研究方法

1.1 研究點(diǎn)概況

選擇松茸產(chǎn)量較高且具有高山松和高山櫟分布的云南省迪慶州香格里拉縣建塘鎮(zhèn)吉迪村為研究地點(diǎn)。該村所在的香格里拉縣平均海拔3300m,干濕季分明且晝夜溫差較大。年平均氣溫為7.3℃,年平均最低氣溫為1.9℃,年平均最高氣溫為14.3℃,年平均降水量為38.5mm,年平均相對(duì)濕度為61%(中國(guó)氣象數(shù)據(jù)網(wǎng)http: //data.cma.cn/site/index.html香格里拉氣象站數(shù)據(jù))。其中高山櫟林研究點(diǎn)(99°37′52.59″E,28°05′38.48″N)平均海拔為3747m,森林建群種為高山櫟(Quercussemecarpifolia),約占45.19%,平均高度為7.71m；高山松林研究點(diǎn)(99°38′28.73″ E,28°04′11.09″N)平均海拔為3452m,森林建群種為高山松(Pinusdensata),約占64.06%,平均高度為6.20m。兩種森林類型下均有杜鵑灌叢分布。

1.2 樣品采集

土樣采集工作于2014年8月上旬完成,該時(shí)間段為松茸出菇的活躍期。為使取樣具有代表性,在兩種林型各設(shè)置了5個(gè)20m×20m的重復(fù)樣方。為避免假重復(fù),樣方間的距離均大于25m,且每個(gè)樣方中至少有3個(gè)距離大于2m的松茸菌塘。去除土壤腐殖質(zhì)層后,在每個(gè)樣方中,用土鉆采集3個(gè)菌塘的礦質(zhì)層0—10cm處的土壤。作為對(duì)照,再根據(jù)五點(diǎn)取樣法采集5個(gè)非菌塘的礦質(zhì)層0—10cm處的土壤。采集的土樣先過(guò)4mm篩,然后用冰袋保鮮及時(shí)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。所有土樣一部分風(fēng)干用于土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定,另一部分保存在-20℃冰箱用于土壤微生物分析。

本實(shí)驗(yàn)共10個(gè)樣方,80份土壤樣品。后期處理中,按樣方將重復(fù)樣品均勻合并,每個(gè)樣方有2份土壤樣品：一份菌塘礦質(zhì)層土樣和一份非菌塘礦質(zhì)層土樣。最終共有20份土壤樣品用于后面的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析和土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定。

1.3 土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定

用于化學(xué)性質(zhì)測(cè)定的土壤首先過(guò)2mm的篩,一部分用碳氮分析儀(Vario MAX CN,Germany)測(cè)定土壤全碳和全氮含量,用ICP-AES分析儀測(cè)定土壤全磷含量。另一部分經(jīng)研磨再過(guò)0.25mm篩后用精密酸度計(jì)(PHS- 3C,Shanghai)測(cè)定土壤pH值。測(cè)定過(guò)程交由中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園生物地球化學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.4 土壤微生物群落PLFAs測(cè)定

土壤微生物群落組成的測(cè)定,采用PLFA生物標(biāo)記法。PLFA的提取過(guò)程參考Bossio和Scow[31]的方法,測(cè)定過(guò)程由中國(guó)科學(xué)院華南植物園退化生態(tài)系統(tǒng)植被恢復(fù)與管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.5 數(shù)據(jù)處理

對(duì)PLFA原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,包括每個(gè)樣品中PLFA的組成、百分含量和生物量等信息。其中,單個(gè)PLFA的百分含量表示該特征PLFA占總提取的PLFAs量的百分?jǐn)?shù)[30]。單個(gè)PLFA的生物量由內(nèi)標(biāo)19:0的反應(yīng)值轉(zhuǎn)換而來(lái),單位為nmol/g,表示每克干土中該P(yáng)LFA的含量,公式如下：

用R軟件包(vegan)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。測(cè)定微生物多樣性的指標(biāo),包括Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)、Pielou均勻度指數(shù)(Evenness,J)和PLFAs豐度(Richness,S)。具體計(jì)算公式如下：

(1)Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)[30,32]：

式中,S表示樣品中 PLFA生物標(biāo)記的數(shù)目,即豐度,Pi表示第i個(gè)種占總數(shù)的比例。

(2)Pielou均勻度指數(shù)(J)[30, 32]：

用百分含量、生物量和多樣性指數(shù)表征土壤微生物群落組成。根據(jù)各個(gè)變量的數(shù)據(jù)分布屬性,分別采用二項(xiàng)分布檢驗(yàn)(Binomial test,針對(duì)百分含量),雙因素方差分析(Two-way ANOVA,針對(duì)生物量)和泊松分布檢驗(yàn)(Poisson test,針對(duì)總PLFAs多樣性、均勻度和豐度)進(jìn)行菌塘、林型及其交互作用對(duì)土壤微生物組成影響的顯著性檢驗(yàn)。用非參數(shù)多元方差分析法(Permutational analysis of variance,PERMANOVA)分析群落結(jié)構(gòu)差異,及其與菌塘和林型的相互關(guān)系,并通過(guò)典范對(duì)應(yīng)分析(Canonical correspondence analysis,CCA,CANOCO 4.5軟件)偶聯(lián)與之相關(guān)的土壤化學(xué)因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌塘的土壤微生物群落組成

不同的磷脂脂肪酸表征不同的微生物類群[33],表1顯示了所有樣品中出現(xiàn)的PLFAs及其代表的微生物類群。所有樣品中共出現(xiàn)了76種PLFAs,每個(gè)樣品中平均有(40±5)種。

菌塘中共計(jì)出現(xiàn)63種PLFAs,其中主要的10種PLFAs分別為指代真菌的18:2ω6,9c(8.49%)、18:1ω9c(7.51%)和18:3 w6c (6,9,12)(2.44%),共占18.44%；指代革蘭氏陰性菌的19:0 cyclo w8c,占3.78%；指代革蘭氏陽(yáng)性菌的15:0 iso,占3.51%；未被鑒定的非特異性脂肪酸16:0(16.96%)、17:1 anteiso B(13.77%)、18:1 w6c(6.85%)、16:1 w6c(4.75%)和18:0(3.16%),共占45.49%。

表1 用于微生物生物標(biāo)記的磷脂脂肪酸

GNB: 革蘭氏陰性菌 Gram-negative bacteria;GPB: 革蘭氏陽(yáng)性菌 Gram-positive bacteria;AMF: 叢枝菌根真菌 Arbuscular mycorrhizal fungi;F/B: 真菌/細(xì)菌比 Ratio of fungal to bacterial PLFAs;GNB/GPB: 革蘭氏陰性菌/陽(yáng)性菌比 Ratio of Gram-negative bacterial to Gram-positive bacterial PLFAs

2.2 菌塘和林型對(duì)土壤微生物群落組成的影響

總結(jié)土壤微生物群落組成的各個(gè)指標(biāo)在菌塘和林型間的差異(表2),統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),土壤微生物的百分含量、生物量和多樣性均在不同程度上受菌塘的影響,植被類型對(duì)土壤微生物群落的影響僅體現(xiàn)在個(gè)別類群的生物量方面。

菌塘內(nèi)真菌百分含量顯著增加(P< 0.001),革蘭氏陰性菌(GNB,P< 0.05)和革蘭氏陽(yáng)性菌(GPB,P< 0.01)的百分含量顯著降低。例如,真菌百分含量在高山櫟林內(nèi)由12.03±0.25增加為19.98±3.38,在高山松林內(nèi)由13.92±0.39增加到16.89±1.02。菌塘內(nèi)放線菌和叢枝菌根真菌(AMF)的百分含量減少,但不顯著(P> 0.05)。菌塘內(nèi)真菌/細(xì)菌生物量比(F/B)顯著高于非菌塘(P< 0.01)。總的來(lái)說(shuō),菌塘并不影響土壤微生物總PLFAs多樣性(Shannon多樣性指數(shù))和豐度,及各微生物類群的PLFAs豐度,但菌塘內(nèi)土壤微生物總PLFAs均勻度(Pielou均勻度指數(shù))顯著低于非菌塘(P< 0.05)。

除了真菌和AMF的生物量,林型對(duì)大部分表征土壤微生物群落組成指標(biāo)的影響并不顯著,也不與菌塘產(chǎn)生交互作用。林型對(duì)真菌和AMF生物量的影響表現(xiàn)為：真菌和AMF生物量在高山櫟林內(nèi)均顯著高于高山松林(P< 0.05)。

表2 菌塘、林型及其交互作用對(duì)土壤微生物百分含量、生物量和多樣性的影響

ns:P> 0.05, *P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001；a: 采用二項(xiàng)分布檢驗(yàn);b: 采用雙因素方差分析；c: 采用泊松分布檢驗(yàn)

2.3 菌塘和林型對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)非參數(shù)多元方差分析發(fā)現(xiàn)(表3),菌塘、林型均顯著影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu),其中菌塘(R2=0.263,P< 0.01)的影響大于林型(R2=0.173,P< 0.05)的影響,但兩者的交互作用對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響不顯著(P> 0.05)。

表3 菌塘、林型及其交互作用對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的非參數(shù)多元方差(PERMANOVA)分析

*P< 0.05,**P< 0.01;df：自由度Degree of freedom；Sq：均方Mean Square；F.Model：F檢驗(yàn)的結(jié)果The result of F-test

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)與菌塘、林型和土壤化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系

對(duì)樣品中出現(xiàn)頻率最高的40種磷脂脂肪酸進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)分析(Canonical correspondence analysis,CCA),發(fā)現(xiàn)除菌塘和森林類型外,各個(gè)土壤化學(xué)指標(biāo)也在不同程度上與土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)相關(guān)(圖1)。然而進(jìn)一步分析表明,這些土壤化學(xué)指標(biāo)主要與林型相關(guān)聯(lián)(表4),表現(xiàn)為高山櫟林的全碳(P< 0.001)、全氮(P< 0.05)、全磷(P< 0.001)和碳氮比(P< 0.001)顯著高于高山松林,而pH值顯著低于高山松林(P< 0.05)。對(duì)于菌塘和非菌塘,土壤化學(xué)性質(zhì)間并無(wú)顯著差異(表4)。

表4 菌塘、林型及其交互作用對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

ns:P> 0.05, *P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001

圖1 土壤微生物PLFAs與土壤化學(xué)性質(zhì)的典范對(duì)應(yīng)分析 Fig.1 Canonical correspondence analysis of soil microbial PLFAs and soil chemical factorsQs: 高山櫟林 Q. semecarpifolia; Pd: 高山松林 P. densata; Shiro: 菌塘; Non-Shiro: 非菌塘;TC: 全碳 Total carbon; TN: 全氮 Total nitrogen; TP: 全磷 Total phosphorus; C/N: 碳氮比 Ratio of total carbon to total nitrogen

3 討論

掌握菌塘內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)及其與宿主植物的相互關(guān)系,對(duì)科學(xué)管理具有高附加值的松茸資源,保障其產(chǎn)量和質(zhì)量、并最終實(shí)現(xiàn)人工栽培具有重要意義。在自然界松茸與松科和殼斗科的多個(gè)物種產(chǎn)生共生關(guān)系。過(guò)去針對(duì)赤松(Pinusdensiflora)林[23- 25, 28-29]、偃松(Pinuspumila)林[7]、云杉(Piceaglehnii)林[8]、鐵杉(Tsugasieboldii)林[4]等宿主森林的研究為我們認(rèn)知松茸菌塘內(nèi)的微生物群落組成奠定了基礎(chǔ)。但這些研究結(jié)果通常相對(duì)獨(dú)立、缺乏橫向?qū)Ρ?限制了我們對(duì)松茸菌塘微生物群落特征的規(guī)律性認(rèn)知。本研究不僅首次研究了殼斗科高山櫟林內(nèi)的菌塘微生物群落特征,還將其與高山松林進(jìn)行對(duì)比分析,淺析其共性和規(guī)律。

研究主要發(fā)現(xiàn),盡管高山櫟林的真菌和AMF的生物量顯著高于高山松林(表2),且兩種林型在微生物群落結(jié)構(gòu)上存在顯著差異(表3、圖1),但高山櫟林和高山松林間菌塘微生物群落特征的差異并不顯著。此外,非參數(shù)多元方差分析也表明菌塘對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響大于林型(表3),且兩者間不產(chǎn)生交互作用。綜上所述,研究認(rèn)為本研究涉及的兩種林型間松茸菌塘微生物群落的特征基本相似,具有共性。然而該共性是否普遍存在并具有規(guī)律？有待更加廣泛的取樣和深入的研究來(lái)解答。

松茸菌塘具有特定的微生物群落特征。與非菌塘相比,菌塘內(nèi)的真菌含量增加,可能主要由松茸本身為優(yōu)勢(shì)類群所決定。無(wú)論采用哪種方法,前人已知的研究結(jié)果均表明菌塘內(nèi)細(xì)菌減少[23, 25]。本研究再次印證了該觀點(diǎn),發(fā)現(xiàn)GPB和GNB在菌塘中的百分含量顯著下降。分析其原因,目前存在兩種可能性解釋。首先,根據(jù)最新研究,松茸子實(shí)體在實(shí)驗(yàn)室離體條件下會(huì)分泌由吡喃糖氧化酶(pyranose oxidase)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫,可抑制致病菌立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的生長(zhǎng)[42]。本研究中土壤取樣時(shí)間恰好是出菇期,如果在野外條件下松茸子實(shí)體也能分泌過(guò)氧化氫,可能是解釋GPB和GNB減少的原因。其次,Park等人[43]從松茸擔(dān)子果、赤松根尖和菌塘土壤中均分離到一個(gè)木霉屬新種Trichodermasongyi,該屬物種通常為植物病原體的生物控制媒介,而Vaario等[26]的文章也提出,木霉屬真菌與松茸總是存在共生關(guān)系,因此另一種可能即是松茸在木霉屬物種的協(xié)助下抑制菌塘內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)。

本研究還發(fā)現(xiàn),從PLFAs多樣性看,菌塘與非菌塘并不存在顯著差異,也就是說(shuō)菌塘也具有豐富的類群多樣性(表2),這與Vaario等[26]的觀點(diǎn)相似。另外,菌塘與非菌塘的總PLFAs生物量也基本等量。有趣的是,針對(duì)北方溫帶森林外生菌根菌Piloderma菌絲墊和非菌絲墊(與本文菌塘和非菌塘概念相似)的定量PCR研究也有類似發(fā)現(xiàn)[44]。這可能說(shuō)明在外生菌根菌主導(dǎo)的土壤菌絲際,微生物總生物量與周邊土壤保持一致。然而,菌塘的PLFAs均勻度顯著下降,說(shuō)明盡管總生物量和多樣性維持穩(wěn)定,但菌塘內(nèi)各組分間的相對(duì)含量較非菌塘發(fā)生了變化,這種變化的結(jié)果使得各組分間的相對(duì)含量差異增大。最為典型的代表便是真菌與細(xì)菌的相對(duì)變化上,菌塘內(nèi)真菌比例增加,細(xì)菌比例下降,導(dǎo)致菌塘內(nèi)F/B顯著增加(表2)。

分析發(fā)現(xiàn)盡管兩種林型間的pH、全碳、全氮、全磷和碳氮比存在顯著差異(表4),但菌塘和非菌塘的土壤化學(xué)特征基本相同,說(shuō)明松茸主導(dǎo)菌塘后并未改變土壤的化學(xué)性質(zhì)。該結(jié)果與Vaario等[26]在的芬蘭的研究結(jié)果相同。最后,值得注意的是,仍有超過(guò)一半的PLFAs未能被鑒定(表2),在一定程度上限制了我們對(duì)菌塘微生物群落的全面理解,未來(lái)可結(jié)合其他研究手段,特別是結(jié)合下一代測(cè)序技術(shù)深入解析松茸菌塘的微生物群落特征。

4 結(jié)論

綜上所述,松茸菌塘內(nèi)的土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)特征與非菌塘存在差異,菌塘的真菌含量和F/B增加,細(xì)菌含量減少,表明松茸改變了菌塘的土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu),導(dǎo)致菌塘具有特定的微生物群落特征。此外,菌塘和非菌塘微生物群落特征的差異在高山櫟和高山松林內(nèi)表現(xiàn)相似,說(shuō)明松茸對(duì)菌塘微生物群落結(jié)構(gòu)的影響不隨宿主森林類型而改變。

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