丁 咚，陳亞娟，崔進榮，魏建華，張玉紅，張杰偉*

(1.東北林業(yè)大學(xué), 森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室, 黑龍江 哈爾濱 150040；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心, 農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100097)

【研究意義】C重復(fù)序列結(jié)合因子/干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(c-repeat binding factor/dehydration-responsive element binding protein 1, CBF/DREB1)是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，屬于AP2/EREBP(apetla2/ehylene responsive element binding protein)類轉(zhuǎn)錄因子亞家族。迄今已發(fā)現(xiàn)的CBF/DREB1 轉(zhuǎn)錄因子基因內(nèi)均無內(nèi)含子，且含有一段由約60個氨基酸構(gòu)成的AP2/ERF DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(AP2結(jié)構(gòu)域)，除此之外，在AP2結(jié)構(gòu)域之前含有保守的核定位信號區(qū)(nuclear localization signal, NLS)：PKK/RPAGRxKFxETRHP(PKKPAGR)序列，之后含有DSAWR序列，這兩段氨基酸序列已經(jīng)成為區(qū)分其他AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子的特征序列[1-2]。 植物中CBF/DREB1類轉(zhuǎn)錄因子都能通過AP2 結(jié)構(gòu)域特異性的與CRT/DRE (c-repeat/dehydration-responsive element)順式作用元件(A/GCCGAC)結(jié)合，激活響應(yīng)低溫、干旱和高鹽等非生物脅迫應(yīng)答基因，從而提高植物的抗逆性[3-4]?！厩叭搜芯窟M展】 1997年，Stockinger 等利用酵母單雜交方法首次從擬南芥cDNA文庫中分離到DRE /CRT結(jié)合蛋白并命名為AtCBF1[5]。隨后，Gilmour等從低溫處理后的擬南芥cDNA 文庫中鑒定出與AtCBF1在同一染色體上順序排列的兩個DRE /CRT 結(jié)合蛋白AtCBF2/DREB1C 和AtCBF3/DREB1A[6]。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，AtCBF4/DREB1D受干旱和ABA 誘導(dǎo)且不受低溫脅迫誘導(dǎo)[7]，AtCBF5/DDF2/DREB1E和AtCBF6/DDF1/DREB1F均能夠響應(yīng)高鹽脅迫誘導(dǎo)[8-9]。目前，已經(jīng)從玉米[10]、胡楊[11]、海島棉[12]等多種植物中分離鑒定出CBF 轉(zhuǎn)錄因子。由美國能源部啟動并實施的楊樹全基因組測序計劃的完成[13]，為后續(xù)通過生物信息學(xué)挖掘、鑒定和分析楊樹功能基因提供重要的基礎(chǔ)?！颈狙芯壳腥朦c】本研究從毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫出發(fā)，重點分析毛果楊CBF基因家族進化關(guān)系、編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點等，為進一步研究楊樹CBF 蛋白的生物學(xué)功能以及其磷酸化修飾提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 楊樹CBF/DREB1基因家族基因組、cDNA和蛋白序列的獲得

擬南芥(Arabidopsisthaliana)CBF/DREB1基因及其推導(dǎo)的蛋白序列來自TAIR數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org)；毛果楊(Populustrichocarpa)CBF/DREB1基因及其推導(dǎo)的蛋白序列下載自phytozome 數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Ptrichocarpa)；胡楊(P.euphratica)CBF/DREB1基因及其推導(dǎo)的蛋白序列下載自胡楊基因組數(shù)據(jù)(http://me.lzu.edu.cn/stpd/#main_tabs=0)；海島棉CBF蛋白序列來自NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

分別以擬南芥AtCBF1(AT4G25490)、AtCBF2 (AT4G25470)、AtCBF3(AT4G25480)、AtCBF4 (AT5G51990)、AtCBF5(AT1G63030)和AtCBF6 (AT1G12610)蛋白序列為參比序列，利用phytozome 數(shù)據(jù)庫(楊樹)中Blast 程序進行BlastP檢索，檢索結(jié)果的全序列E值大于e-8的舍去，再利用美國國家生物技術(shù)信息中心提供的在線CDS(conserved domain search)程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)預(yù)測這些蛋白有無AP2結(jié)構(gòu)域，同時利用歐洲生物信息研究所在線Clustal Omega程序進行多重序列比對，尋找AP2結(jié)構(gòu)域前后是否含有PKKPAGR和DSAWR序列，同時具有這兩個特征的蛋白序列屬于CBF/DREB1基因家族。

1.2 植物CBF/DREB1基因家族編碼蛋白系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建及保守基序分析

利用Clustal X(2.0)[14]軟件對鑒定出所有毛果楊CBF蛋白、6個擬南芥CBF蛋白、8個胡楊CBF蛋白[15]和5個海島棉CBF蛋白[12]進行多重序列比對，使用MEGA 6.0[16]軟件，采用鄰接(neighbor-joining，NJ)算法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進行1000 次Bootstrap 抽樣。應(yīng)用在線軟件MEME(http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)對擬南芥和毛果楊的CBF蛋白保守基序進行分析[17]。參數(shù)設(shè)置如下：基序的最大發(fā)現(xiàn)數(shù)目是2 個，其它參數(shù)為程序默認值。

1.3 楊樹CBF/DREB1基因家族編碼蛋白磷酸化位點預(yù)測

利用NetPhos 3.1 Server在線軟件[18](http://www.cbs.dtu.dk)對鑒定出所有毛果楊CBF蛋白序列進行磷酸化位點預(yù)測，所有參數(shù)都選用程序默認值。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹CBF/DREB1基因家族的鑒定和命名

分別以6個擬南芥CBF蛋白序列為參比序列，利用phytozome 數(shù)據(jù)庫提供的Blast P程序進行檢索，共得到11個毛果楊候選CBF基因。利用保守基序在線預(yù)測軟件MEME進行驗證AP2保守結(jié)構(gòu)域的存在，同時在其前后分別含有PKKPAGR和DSAWR序列，初步確定了6個毛果楊CBF基因。毛果楊CBF基因分布在第1、4、9、12和15五條染色體上，根據(jù)通用植物基因的命名方法，對鑒定到的6個CBF基因進行了命名，并統(tǒng)計了這6個基因?qū)?yīng)的轉(zhuǎn)錄本、別名、染色體定位、基因長度以及對應(yīng)的推導(dǎo)蛋白長度和內(nèi)含子個數(shù)等，推導(dǎo)出這6個基因的蛋白質(zhì)長度從219個氨基酸到225個氨基酸不等(表1)。

表1 毛果楊CBF/DREB1基因家族的基本特征

圖1 擬南芥和毛果楊的CBF/DREB1家族基因編碼蛋白保守基序分布Fig.1 Distribution of conserved motifs in Arabidopsis and P. trichocarpa CBF/DREB1 proteins

2.2 楊樹CBF/DREB1基因家族保守結(jié)構(gòu)域分析

利用在線軟件MEME對6個AtCBF蛋白序列和6個PtCBF蛋白序列保守基序進行分析，結(jié)果表明擬南芥和毛果楊CBF基因家族蛋白序列中均包含由基序1(相似度為5.0e-454)和基序2(相似度為8.2e-259)共同構(gòu)成的AP2保守結(jié)構(gòu)域(圖1)。

2.3 楊樹CBF/DREB1基因家族蛋白相似性和系統(tǒng)進化分析

利用進化樹分析軟件MEGA 6.0 對6個擬南芥AtCBF蛋白、5個海島棉GbCBF蛋白、8個胡楊PeuCBF蛋白和6個毛果楊PtCBF蛋白全蛋白序列進行進化分析。結(jié)果顯示：這26個CBF按照同源進化關(guān)系可以分為3個亞家族，分別含有13、4和8個成員(圖2)。第Ⅰ亞家族由擬南芥、海島棉、胡楊和毛果楊共同組成；第Ⅱ亞家族由胡楊和毛果楊組成，第Ⅲ亞家族中不含有擬南芥成員。毛果楊CBF/DREB1基因家族分布于3個不同的亞家族中，其中毛果楊PtCBF5和PtCBF6、胡楊PeuCBF1和PeuCBF5、擬南芥AtCBF1～6、海島棉GbCBF1～3聚類于第Ⅰ亞家族；毛果楊PtCBF3和PtCBF4、胡楊PeuCBF4和PeuCBF8聚類

于第Ⅱ亞家族；毛果楊PtCBF1、PtCBF2、胡楊PeuCBF2、PeuCBF3、PeuCBF6、PeuCBF7、海島棉GbCBF4和GbCBF5聚類于第Ⅲ亞家族。利用歐洲生物信息研究所在線Clustal Omega程序?qū)?個毛果楊的蛋白序列進行多重序列比對，發(fā)現(xiàn)他們的氨基酸相似性在46.45 %～81.31 %，其中PtCBF3 和PtCBF4氨基酸序列的相似性達到 81.31 %(表2)。

圖2 擬南芥、海島棉、胡楊和毛果楊的CBF/DREB1蛋白進化樹Fig.2 Phylogenetic tree for Arabidopsis,Gossypium barbadense,P. euphratica and P. trichocarpa CBF/DREB1 proteins

PI-PLC家族PtCBF2PtCBF3PtCBF4PtCBF5PtCBF6PtCBF165.950.548.559.6458.11PtCBF251.7649.7557.2758.41PtCBF381.3149.346.45PtCBF448.1147.62PtCBF579.27

表3毛果楊基因組中CBF/DREB1蛋白潛在磷酸化位點分析

Table 3 Analysis of the CBF/DREB1 proteins potential phosphorylation site inP.trichocarpa

CBF家族絲氨酸Serine蘇氨酸Threoine酪氨酸TyrosinePtCBF12141PtCBF21451PtCBF31070PtCBF41573PtCBF51561PtCBF61971

2.4 楊樹CBF/DREB1基因家族蛋白磷酸化位點預(yù)測

利用在線軟件NetPhos 3.1 Serverl對6個毛果楊CBF/DREB1蛋白進行磷酸化位點預(yù)測，結(jié)果顯示PtCBF1～6蛋白中存在著17～27個絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸潛在磷酸化位點，預(yù)測磷酸化位點主要是以絲氨酸的形式存在，其次是蘇氨酸，絡(luò)氨酸的磷酸化位點最少(表3)。預(yù)測PtCBF1潛在磷酸化位點中存在21個絲氨酸、4個蘇氨酸和1個酪氨酸位點。PtCBF3潛在蛋白磷酸化位點中不含有酪氨酸(圖3)。

3 討 論

本研究鑒定毛果楊CBF/DREB1基因家族含有6個成員，而已鑒定的擬南芥[18]、水稻[18]、海島棉[12]和胡楊[15]CBF/DREB1基因家族分別含有6、10、5和8個成員，這說明在植物進化過程中，CBF/DREB1基因可能經(jīng)歷了不斷發(fā)生譜系的特異擴張和拷貝丟失。毛果楊CBF/DREB1基因家族的6個成員均只含有1個外顯子，均含有AP2結(jié)構(gòu)域，且在AP2結(jié)構(gòu)域的前后分別含有PKKPAGR和DSAWR序列，這表明CBF/DREB1基因家族的高度保守性，推測這些轉(zhuǎn)錄因子在植物諸多生理過程中起著類似作用。不同植物中CBF/DREB1基因家族含有的成員數(shù)目存在差異，推測不同植物的各成員在特定組織響應(yīng)低溫、干旱和高鹽等信號后精細調(diào)節(jié)各生理過程。

進化分析表明，毛果楊CBF/DREB1基因家族分布于不同的亞家族中，PtCBF5、PtCBF6、PeuCBF1、PeuCBF5、AtCBF1～6和GbCBF1～3聚類于第Ⅰ亞家族；PtCBF3、PtCBF4、PeuCBF4和PeuCBF8聚類于第Ⅱ亞家族；PtCBF1、PtCBF2、PeuCBF2、PeuCBF3、PeuCBF6、PeuCBF7、GbCBF4和GbCBF5聚類于第Ⅲ亞家族。目前，CBF/DREB1基因家族各成員確切的功能分析主要集中在擬南芥中。近年，伴隨著植物基因組學(xué)、生物信息學(xué)等新興學(xué)科的興起，大量的CBF基因從不同植物中克隆出來，部分林木CBF/DREB1基因成功克隆并功能也得到初步分析。第Ⅲ亞家族中毛果楊PtCBF1、PtCBF2和胡楊PeuCBF2、PeuCBF3、PeuCBF6 和PeuCBF7 與并不是一一對應(yīng)關(guān)系，表明經(jīng)過長期進化選，毛果楊和胡楊CBF/DREB1基因也發(fā)生了分離，這與賈會霞[15]等的研究結(jié)果一致。胡楊PeuCBF1～3和PeuCBF5～7均在雄花序和雌花序的表達量較高，且胡楊PeuCBF1～3和PeuCBF5～6主要響應(yīng)低溫脅迫。據(jù)此推測： 毛果楊PtCBF1和PtCBF2可能也主要在雄花序和雌花序中表達且響應(yīng)低溫脅迫。最近的研究發(fā)現(xiàn)，胡楊PeuCBF4過量表達轉(zhuǎn)化三倍體毛白楊，獲得的轉(zhuǎn)基因毛白楊的光和效率較對照(野生型和轉(zhuǎn)空載體轉(zhuǎn)基因毛白楊)增加34.7 %～165.7 %、瞬間水利用效率增加48.9 %～103.7 % 、葉綠素熒光fv/fm增加2.14 %～5.89 % ；同時SOD活性增加、MDA含量降低；轉(zhuǎn)基因毛白楊表現(xiàn)出PeuCBF4、PtRCI2A 和PtDI21表達量顯著上調(diào)同時伴隨有植株矮化現(xiàn)象。表明：胡楊PeuCBF4過量表達能夠顯著增強轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性[11]。鑒于毛果楊PtCBF4與PeuCBF4同源性最高，據(jù)此推測毛果楊PtCBF4在植物抗逆生理中發(fā)揮重要作用。聚類在一起的不同植物的同源基因可能具有不同的生物學(xué)功能[19]，因此不能簡單推測毛果楊CBF/DREB1基因家族各成員的生物學(xué)功能，其各成員確切的生物學(xué)功能還需要逐一進行功能驗證。

圖3 毛果楊CBF/DREB1蛋白磷酸化位點預(yù)測Fig.3 Phosphorylation site prediction of CBF/DREB1 proteins in P. trichocarpa

磷酸化分析表明，毛果楊PtCBFs蛋白存在大量潛在磷酸化位點。目前，植物CBF/DREB1 轉(zhuǎn)錄因子確切的磷酸化作用尚未見報道。研究發(fā)現(xiàn)御谷PgDREB2A 是一個磷酸化蛋白，其體外磷酸化位點是蘇氨酸殘基。御谷PgDREB2A蛋白磷酸化后不能與RD29A啟動子上DRE 元件(ACCGAC)結(jié)合，在磷酸酶作用下，PgDREB2A 結(jié)合DRE 元件的能力得到了恢復(fù)，表明：御谷PgDREB2A蛋白磷酸化作用負調(diào)控其對DNA 的結(jié)合活性[20]。毛果楊PtCBFs蛋白中潛在的磷酸化位點還需要通過定點突變、體外磷酸化等試驗進一步研究和驗證。

4 結(jié) 論

毛果楊基因組中鑒定出6個CBF/DREB1基因家族成員，均不含有內(nèi)含子，位于毛果楊的第1、4、9、12和15染色體上。毛果楊CBF/DREB1蛋白均含有AP2結(jié)構(gòu)域及其前后的特征序列：PKKPAGR和DSAWR均含有大量潛在的磷酸化位點。

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