勵 炯，邱紅鈺，賈彥博，王紅青，李 瑋

(杭州市食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310017)

糖尿病是一種以胰島素分泌或作用缺陷引起的高血糖為特征的代謝性疾病,易引起患者的糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂[1]。預計到2030 年，中國的糖尿病患病率將達11.6%，居各國之首，且以老年人為主，呈日益增多的趨勢[2]。目前，針對糖尿病患者的保健食品和特殊醫(yī)學用途配方食品(Food for special medical purpose,FSMP)種類繁多，常應用于糖尿病、呼吸系統(tǒng)綜合疾病、腎病、腫瘤、炎性腸病、食物蛋白過敏、肥胖、先天性代謝缺陷等病癥的營養(yǎng)輔助[3-4]。雖然近幾年國家衛(wèi)計委出臺了《GB 29922-2013 特殊醫(yī)學用途配方食品通則》和《GB 29923-2013 特殊醫(yī)學用途配方食品良好生產(chǎn)規(guī)范》，國家食品藥品監(jiān)督管理總局也于2016年7月1日實施頒布《特殊醫(yī)學用途配方食品注冊管理辦法》，進一步規(guī)范和管理FSMP的注冊，但相應的監(jiān)督管理和法律責任等不完善。近年來已有很多文獻對中成藥和保健食品中非法添加的降糖類化學成分進行研究[5-7]，發(fā)現(xiàn)一些不法商家在利益驅(qū)動下，為了增強降糖效果，可能會在針對糖尿病人的FSMP產(chǎn)品中非法添加各種降糖類化學藥物，患者往往在不知情的情況下長期服用，造成不可挽救的后果。

目前，檢測化學降糖成分的方法主要有薄層色譜法[8-9]、高效液相色譜法[10-12]、毛細管電泳法[13]、離子選擇性電極法[14]、氣相色譜-質(zhì)譜法[15]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[16-18]，其中液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法兼具靈敏度高及抗干擾性強的優(yōu)勢，廣泛應用于降糖類非法添加化學成分的定性確證。

樣品提取和凈化作為關(guān)鍵技術(shù)，會直接影響方法靈敏度和精密度，尤其是部分FSMP配料中脂肪或者磷脂含量較多，基質(zhì)效應較明顯。前處理凈化方法多以普通的固相萃取小柱凈化，但其步驟繁瑣，操作不當易造成損失而影響定量準確性。本研究采用通過式固相萃取技術(shù)，以O(shè)asis PRiME HLB 固相萃取柱凈化樣品，上樣前無需活化和平衡，樣液直接加載至SPE柱以吸附脂肪和磷脂類化合物，建立了針對糖尿病患者的特殊醫(yī)學用途配方食品中13種非法添加降糖類化學成分的通過式固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，方法靈敏、簡便、高效，可滿足日常特殊醫(yī)學用途配方食品的質(zhì)量監(jiān)測需求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

美國Agilent 1290高效液相色譜儀、Agilent 6495串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀、Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國Millipore公司)、MS3旋渦混合器(德國IKA公司)。

對照品甲苯磺丁脲(批號90126，質(zhì)量分數(shù)99.0%)購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；格列本脲(批號10135-200404，質(zhì)量分數(shù)100%)、格列齊特(批號100269-201004，質(zhì)量分數(shù)99.9%)、格列吡嗪(批號100281-200602，質(zhì)量分數(shù)99.4%)、格列喹酮(批號100280-201002，質(zhì)量分數(shù)99.3%)、格列美脲(批號100674-200301，質(zhì)量分數(shù)99.1%)、馬來酸羅格列酮(批號100952-200701，質(zhì)量分數(shù)99.5%)、瑞格列奈(批號100753-200501，質(zhì)量分數(shù)99.8%)、鹽酸吡格列酮(批號100634-201202，質(zhì)量分數(shù)100%)、鹽酸二甲雙胍(批號100664- 201203，質(zhì)量分數(shù)100%)、鹽酸苯乙雙胍(批號100922-201001，質(zhì)量分數(shù)99.7%)、格列波脲(批號520026-201401，質(zhì)量分數(shù)99.9%)購于中國食品藥品檢定研究院；鹽酸丁二胍(批號1-RLJ-70-2，質(zhì)量分數(shù)96%)購于Toronto Research Chemicals Inc.。冰乙酸、乙酸銨(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，德國Merck公司)；Oasis PRiME HLB 固相萃取柱( 6 mL中含200 mg，美國Waters公司)。

1.2 標準溶液的配制

分別精密稱取13種降糖對照品標準品各10 mg，分別用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，作為對照品儲備溶液(質(zhì)量濃度為1 000 mg/L)。分別精密吸取上述對照品儲備溶液適當體積于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，配成2.0、5.0、10、20、50、100 μg/L的混合標準品系列溶液。

1.3 樣品前處理

取2 g樣品置50 mL聚氟乙烯離心管中，精密加入10 mL含1%甲酸的90%乙腈水溶液，加入2 g氯化鈉和5 g無水硫酸鈉，渦旋混合1 min，超聲提取20 min，5 000 r /min 離心5 min。取8 mL提取液直接加載到PRiME HLB 固相萃取柱上，流速為1滴/s，收集全部流出液。準確移取5.00 mL流出液，40 ℃水浴下氮吹至近干，精密加入0.5 mL 5 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇(80∶20，體積比)，渦旋混勻1 min溶解殘渣，用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：A為含0.1%甲酸的5 mmol/L 乙酸銨溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～10 min，80%～20% A；10 ～10.1 min，20%～80% A ；10.1～13 min，80% A。柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min，進樣量1 μL；運行時間：13 min。

離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測方式(ESI+)；多反應檢測(MRM模式)；干燥氣溫度：200 ℃；干燥氣流速：14 L/min；毛細管電壓：3.5 kV；毛細管出口電壓(Fragmentor)：380 V；校準方法：質(zhì)量軸自動調(diào)諧校正；MRM進行分段掃描：0～1.4 min，鹽酸二甲雙胍；1.4～2.4 min，鹽酸丁二胍；2.4～4.5 min，鹽酸苯乙雙胍；4.5～6.0 min，甲苯磺丁脲；6.0～7.0 min，格列吡嗪和格列齊特；7.0～8.8 min，馬來酸羅格列酮、格列波脲、吡格列酮、格列本脲和格列美脲；8.8～9.4 min，格列喹酮；9.4～13.0 min，瑞格列奈。其他質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 13種降糖類化學成分的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS parameters of 13 anti-diabetic drugs

*quantitative ion pair

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

精密量取質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的13種目標化合物標準溶液分別注入進樣器，隨流動相直接注入質(zhì)譜儀進行母離子和子離子掃描。研究發(fā)現(xiàn)，13種降糖類化學成分在正離子模式下的方法穩(wěn)定性和重復性較負離子模式好，故本方法采用正離子模式進行檢測。

在正離子模式下對13種降糖類化學成分進行母離子掃描，掃描范圍為m/z100～450，得到 [M+H]+峰。確定母離子之后，調(diào)節(jié)毛細管電壓，當毛細管電壓為3.5 kV時一級掃描響應最高。確定母離子及其條件后，繼續(xù)進行子離子掃描，以得到最佳的二級質(zhì)譜條件，經(jīng)儀器自帶的二級質(zhì)譜參數(shù)自動優(yōu)化程序，得到13種目標化合物的二級質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)(表1)。最終將優(yōu)化后得到的定量定性離子對和碰撞能量作為13種降糖類化學成分的掃描參數(shù)。

圖1 13種降糖類化學成分(10 μg/L)的MRM譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 13 anti-diabetic drugs(10 μg/L)

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本文比較了Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)、Waters CORTECS C18(150 mm×2.1 mm，1.6 μm)、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Kinetex C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm ) 4種色譜柱對13種降糖類化學成分色譜行為的影響。鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍和鹽酸丁二胍這3種雙胍類降糖成分，均為含氮類化合物，在色譜柱上易產(chǎn)生二次保留從而使色譜峰拖尾。結(jié)果表明，使用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱時13種降糖類化學成分的色譜峰峰形較好，而采用其他3種色譜柱分析時，3種雙胍類成分均產(chǎn)生比較嚴重的色譜峰拖尾現(xiàn)象。這是因為Waters ACQUITY UPLC BEH色譜柱采用亞乙基橋雜化顆粒技術(shù)，可以保證目標物較好的峰對稱性、柱效以及化學穩(wěn)定性，適用于最廣泛的化合物種類的通用性，在一定程度上解決了在質(zhì)譜上較難分析雙胍類降糖成分的問題。

本文考察了甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液以及甲醇-含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液3組流動相在“1.4”梯度條件下的色譜行為。實驗結(jié)果顯示：甲醇-0.1%甲酸水溶液的目標峰峰形較好，但靈敏度偏低；甲醇-5 mmol/L乙酸銨流動相的目標峰靈敏度明顯提高，但峰形拖尾。本文采用甲醇-含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相，此時13種目標物的峰形較好，靈敏度較高，MRM譜圖見圖1。

表2 正交試驗因素水平Table 2 Orthogonal test factors and levels

2.3 提取及凈化方式的優(yōu)化

降糖類化學成分的提取溶劑一般采用甲醇、乙腈等，而一般通過式固相萃取法提取藥物殘留多采用乙腈為提取溶劑，在提取劑中加入一定比例的甲酸，有助于沉淀樣品中的蛋白質(zhì)。本研究通過對提取劑用量、甲酸比例以及乙腈濃度(分別作為因素A、B、C)進行正交試驗優(yōu)化(每個因素取3個水平，按照L9(33)正交表試驗)，比較10 μg/L加標水平下各因素組合的回收率和凈化效果，選擇最佳配比組合。正交試驗因素見表2。結(jié)果表明，使用10 mL含1%甲酸的90%乙腈水溶液為提取劑可以獲得良好的提取和凈化效果。

除了蛋白質(zhì)，脂類物質(zhì)也是主要的基質(zhì)干擾物，本文采用通過式固相萃取技術(shù)，提取液經(jīng)Oasis PRiME HLB 固相萃取柱凈化，上樣前無需活化和平衡，樣液直接加載至SPE柱以吸附脂肪和磷脂類化合物，不僅有效凈化了樣品溶液，而且顯著提高了樣品分析通量。

2.4 基質(zhì)效應評估

本文通過基質(zhì)效應來評價采用的通過式固相萃取技術(shù)的凈化效率。基質(zhì)效應(ME)以基質(zhì)標準曲線的斜率與溶劑標準曲線的斜率之比進行評估，基質(zhì)標準曲線配制如下：分別取6份空白樣品2.0 g(檢測結(jié)果為陰性的降糖奶粉)于50 mL聚丙烯離心管中，分別精密加入混合對照品儲備溶液(質(zhì)量濃度為1 mg/L)適量，按“1.3”方法制備基質(zhì)標準曲線，配成最終質(zhì)量濃度為2.0、5.0、10、20、50、100 μg/L的基質(zhì)標準品系列溶液，按“1.4”條件進行分析，得到以降糖奶粉為基質(zhì)的基質(zhì)標準曲線，所得的基質(zhì)標準曲線斜率與溶劑標準曲線斜率的百分比進行評估。一般情況下，ME在85%～115%之間不存在明顯的基質(zhì)效應，本文結(jié)果ME為88.4%～96.7%，所以本方法較好地消除了基質(zhì)效應，保證了定性、定量結(jié)果的準確可靠。

2.5 線性關(guān)系、定量下限與重復性

取“1.3”方法配制的標準品系列溶液，分別進樣1 μL，以定量監(jiān)測離子對的離子流中譜峰峰面積(Y)為縱坐標，標準品質(zhì)量濃度(X，μg/L)為橫坐標進行線性關(guān)系考察，結(jié)果見表3。13種降糖類化學成分在2～100 μg/L范圍內(nèi)線性較好(r2均大于0.99)。

取空白的降糖類奶粉樣品2.0 g，加入適當稀釋的混合標準品溶液，按“1.4”方法制備供試品溶液，分別以信噪比為3和10計算13種降糖類化學成分的檢出限(LOD)與定量下限(LOQ)，結(jié)果見表3。13種降糖類化學成分的最低檢出限為0.10～0.35 μg/kg，定量下限為0.3～1.0 μg/kg。

表3 13種降糖類化學成分的線性關(guān)系、檢出限和定量下限Table 3 Linear regression results，LODs and LOQs of 13 anti-diabetic drugs

2.6 方法回收率與精密度

取空白降糖奶粉樣品，每份稱取2.0 g，分別加入適量的混合對照品溶液，使供試品溶液最終加標水平分別為2、5、20 μg/kg，平行6份，按樣品制備方法制備供試品溶液，檢測含量，回收率結(jié)果見表4。13種降糖類化學成分的平均回收率為80.9%～102.8%，相對標準偏差(RSD)為2.6%～8.2%。

表4 特殊醫(yī)學用途配方食品中13種降糖類化學成分的回收率與精密度(n=6)Table 4 Recoveries and precisions of 13 anti-diabetic drugs in FSMP(n=6)

2.7 實際樣品檢測

利用本文建立的方法檢測了5批次降糖奶粉(分別為雅培益力佳SR營養(yǎng)配方粉、雅培怡?？禒I養(yǎng)配方粉、雀巢SUSTAGEN低GI營養(yǎng)配方奶粉、營養(yǎng)獅牌糖友寶配方奶粉和阿爾發(fā)牌富鉻奶粉)、2批次降糖餅干(分別為阿爾發(fā)牌降糖餅干和思朗牌無添糖消化餅干)和1批次降糖麥片(阿爾發(fā)牌消渴麥片)，結(jié)果顯示，13種降糖類化學成分均未檢出。

3 結(jié) 論

本研究建立了通過式固相萃取凈化/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定特殊醫(yī)學用途配方食品中13種非法添加降糖類化學成分的分析方法，優(yōu)化了色譜質(zhì)譜條件以及提取凈化條件。方法無需復雜的樣品前處理，樣品經(jīng)含1%甲酸的90%乙腈水溶液提取，使用Oasis PRiME HLB固相萃取柱進行凈化處理，有效降低了基質(zhì)效應，提高了分析方法的選擇性和靈敏度。

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