潘有福， 趙彥禹， 鄭 翔， 張志敏， 陳忠杰， 徐 丹

(遵義醫(yī)學(xué)院 遺傳學(xué)教研室， 遵義 563000)

黔金絲猴(Rhinopithecusbrelichi)又名灰金絲猴、白肩仰鼻猴、牛尾猴、線狨和猓然獸，是國家Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物， 被IUCN 瀕危物種紅色名錄列為“EN”(瀕危) ，CITES 附錄Ⅰ物種[1-2]。黔金絲猴隸屬靈長目(Primates)猴科(Cercopithecidae)疣猴亞科(Colobinae)仰鼻猴屬(Rhinopi-thecus)。一般認(rèn)為，仰鼻猴屬現(xiàn)有5個(gè)種：黔金絲猴、川金絲猴(Rhinopithecusroxellana)、滇金絲猴(Rhinopithecusbieti)、越南金絲猴(Rhinopithecusavunculus)和怒江(緬甸)金絲猴(Rhinopithecusstrykeri)。其中黔金絲猴、川金絲猴和滇金絲猴是中國特有種。怒江金絲猴于2010年首次在緬甸被發(fā)現(xiàn)，后來在中國云南怒江也有發(fā)現(xiàn)?；C據(jù)顯示金絲猴在第四紀(jì)更新世時(shí)期在中國及周邊鄰近國家廣泛生存。但目前它們分布范圍十分狹小，僅分布在中國境內(nèi)四川、云南、貴州、湖北、陜西、甘肅、西藏等省和自治區(qū)，以及越南北部和緬甸東北部局部區(qū)域。其中，黔金絲猴僅分布于貴州西北部梵凈山。最新種群數(shù)量統(tǒng)計(jì)顯示，黔金絲猴約有800只, 少于川金絲猴(約25 000只)和滇金絲猴(約2000只)，但多于怒江金絲猴(約300只)和越南金絲猴(約200只)[1,3]。

1　黔金絲猴的生境和食性

位于貴州省西北部的梵凈山是黔金絲猴唯一分布區(qū)。梵凈山于1986年成為國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)。該區(qū)覆蓋著較大面積原生性較強(qiáng)的森林植被, 從上至下呈現(xiàn)3個(gè)垂直帶譜：海拔2200 m以上主要為寒溫性針闊混交林和灌叢，海拔1300～2200 m主要是常綠、落葉闊葉混交林和針闊混交林, 海拔1300 m以下主要是常綠闊葉林和低山針葉林。黔金絲猴主要棲息于2000 m以下的常綠、落葉闊葉混交林和低山常綠闊葉林，位于27°49′50″～28°01′30″N，108°45′55″～108°48′30″E間。其中最適宜黔金絲猴生存的區(qū)域位于梵凈山北部，即保護(hù)區(qū)的核心區(qū)，面積約204.53 km2的狹小范圍，占保護(hù)區(qū)總面積47.27%；而保護(hù)區(qū)南部不太適宜黔金絲猴生存，面積約229.00 km2，占保護(hù)區(qū)面積52.73%[2-5]。

對(duì)黔金絲猴食性的研究表明，黔金絲猴食物種類較多，隨季節(jié)不同而變化。春季主要食用葉和花,夏秋季以葉兼成熟或未成熟果實(shí)為主，冬季則以樹芽、樹皮、花苞等為食。此外，落地果實(shí)(如四照花果實(shí))、昆蟲等無脊椎動(dòng)物都是采食對(duì)象[5-8]。與川金絲猴和滇金絲猴不同，近年觀測未發(fā)現(xiàn)黔金絲猴采食地衣，可能與棲息地環(huán)境有關(guān)。黔金絲猴主要生活在700～2000 m間常綠、落葉闊葉混交林中，主要食物常年供應(yīng)相對(duì)充足，地衣類植物分布很少[6]。

2　黔金絲猴主要行為特征及群體結(jié)構(gòu)

黔金絲猴是白天活動(dòng)的靈長類，并有日?；顒?dòng)中的垂直遷移現(xiàn)象，即選擇低海拔夜宿和到高海拔采食的日活動(dòng)模式?？赡苁谦@得食物和躲避天敵的一種權(quán)衡策略。另外黔金絲猴雖是一種晝行性靈長類，但也會(huì)在黃昏或夜晚活動(dòng)。Tan等[9]用紅外相機(jī)陷阱捕捉到黔金絲猴夜間活動(dòng)情況，可能是一種適應(yīng)性行為，通過增加活動(dòng)時(shí)間來獲得更多的食物資源和能力供給。

黔金絲猴的運(yùn)動(dòng)方式與其他幾種金絲猴運(yùn)動(dòng)方式相同，主要是“半臂擺蕩”(Semi-brachiation)型，介于“四足行走型”和“臂擺蕩型”間。而其他靈長類的運(yùn)動(dòng)方式有“垂直攀爬型”如蜂猴(Nycticebuscoucang)，“四足行走型”如獼猴(Macacamulatta)， “臂擺蕩型”如長臂猿科(Hylobatidae)動(dòng)物。黔金絲猴的半臂擺蕩式使它們既能適應(yīng)樹棲生活，又能適應(yīng)地面生活[2,10-11]。

黔金絲猴行為學(xué)可以通過PAE(Posture-act-environment) 編碼系統(tǒng)來進(jìn)行分類和系統(tǒng)編碼，構(gòu)建PAE 行為譜來研究。崔多英等依此觀察記錄了野外和圈養(yǎng)黔金絲猴的14 類行為特征，包括16 種姿勢、107 種動(dòng)作及163 種行為。結(jié)果表明，黔金絲猴行為與川金絲猴和滇金絲猴行為有較多共同點(diǎn)，與獼猴類的行為區(qū)別較大。同時(shí)發(fā)現(xiàn)黔金絲猴在個(gè)體行為和社會(huì)行為方面，與川金絲猴和滇金絲猴相比也有不同點(diǎn)，可能與三者生活環(huán)境差異有關(guān)[12-15]。

關(guān)于黔金絲猴的群體結(jié)構(gòu)，曾認(rèn)為黔金絲猴群體是多雄配多雌的社會(huì)結(jié)構(gòu)[5]，目前認(rèn)為黔金絲猴是以一成年雄猴和多個(gè)雌猴(One-male unit，OMU)的小家庭群體作為最基本單元(group)，一般由5～10只組成；數(shù)量不等的一雄多雌社會(huì)單元構(gòu)成一個(gè)更大群體(Bang, 幫)；但也可在幫的周邊觀察到2～5個(gè)個(gè)體的全雄群。這種雄性替代的母系群是川、滇和黔3 種金絲猴社群結(jié)構(gòu)的共同特征[ 5-6,11-12]。

在野外對(duì)黔金絲猴遷移和聚群行為觀察過程中發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的規(guī)律性現(xiàn)象，即黔金絲猴每年有2 次形成100～400只甚至更多個(gè)體的超級(jí)聚合群(large aggregation)。其生態(tài)適應(yīng)機(jī)制尚有待深入研究[2,5], 但這種聚群活動(dòng)明顯與黔金絲猴生育季節(jié)性相關(guān)。

這種較大聚合群一次出現(xiàn)在春季4—5月，正是成年雌猴集中產(chǎn)仔時(shí)期(主要在3月底到4月底)；另一次在秋季9—10 月，是成年雌猴受孕的有效交配時(shí)期。雌黔金絲猴的性成熟年齡為5～7歲，首次生育年齡為8～9歲，川金絲猴和滇金絲猴為5～6歲；如果幼猴存活至6個(gè)月大母猴的生育間隔周期為3年左右；川金絲猴和滇金絲猴只需要2年[11,16]。

3　黔金絲猴分子遺傳學(xué)研究

分子遺傳學(xué)技術(shù)是研究種系發(fā)育的有力工具。早期利用DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 擴(kuò)增黔金絲猴線粒體進(jìn)化中較保守的基因如細(xì)胞色素b基因或變異較大的DNA控制區(qū)就已表明，黔金絲猴、滇金絲猴和川金絲猴隸屬同一個(gè)屬[17-18]。Li等[18]利用線粒體DNA細(xì)胞色素b基因402 bp片段和12SrRNA 387 bp片段分析3只黔金絲猴、9只滇金絲猴和7只川金絲猴的皮膚、肌肉、毛發(fā)和糞便樣品，顯示4種金絲猴與其他葉猴存在顯著差異，將金絲猴立為一個(gè)獨(dú)立屬是合理的；越南金絲猴的種系關(guān)系不明，但不適合單列為一個(gè)亞屬；文中數(shù)據(jù)支持將黔金絲猴作為一個(gè)獨(dú)立種而非川金絲猴的一個(gè)亞種, 這是對(duì)形態(tài)學(xué)研究的一個(gè)重要支撐和補(bǔ)充[18-19]。最近Yang等[3]的系統(tǒng)進(jìn)化分析和分子多態(tài)分析顯示3個(gè)物種間存在清晰和明顯的差異，各自為獨(dú)立種。另外分子進(jìn)化研究顯示，黔金絲猴的共同祖先生活于大約36萬年前，比川金絲猴(大約91萬年前)和滇金絲猴(133萬年前)近很多年[3]。

為了研究黔金絲猴的遺傳多樣性，Pan等[20]對(duì)野外黔金絲猴128只個(gè)體擴(kuò)增線粒體DNA控制區(qū)可變區(qū)I 400 bp DNA片段，在400個(gè)陽性PCR中，發(fā)現(xiàn)無變異，僅存在一個(gè)單元型。但Yang等用線粒體DNA控制區(qū)可變區(qū)I 650 bp片段對(duì)141只黔金絲猴糞便樣品分析發(fā)現(xiàn)，存在5個(gè)單元型，不過多態(tài)位點(diǎn)最多只有25個(gè)，相比于川、滇金絲猴，仍具有極低的單倍型遺傳多樣性[3]。

核基因組位點(diǎn)具有更多選擇性，但受限于技術(shù)條件而進(jìn)展較慢。從近緣種借用多態(tài)性標(biāo)記適合于瀕危物種；采用糞便、毛發(fā)等非損傷性取樣方法的進(jìn)步能減少對(duì)瀕危物種的傷害，保證研究中材料來源；將二者合理結(jié)合既能不傷害物種又能進(jìn)行遺傳多樣性分析，是黔金絲猴分子遺傳學(xué)研究的一個(gè)重要方向。如Liu等借用人源的72個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記擴(kuò)增滇金絲猴糞便基因組樣品，13個(gè)標(biāo)記獲得成功，呈現(xiàn)適當(dāng)多態(tài)性，有效分析了群體遺傳結(jié)構(gòu)和生殖策略[21]。我們最近采用非損傷性取樣法，對(duì)糞便基因組DNA提取方法進(jìn)行改進(jìn)，從黔金絲猴糞便中成功提取總基因組DNA以及線粒體DNA，擴(kuò)增得到特異性片段，并在分子生物學(xué)水平對(duì)黔金絲猴線粒體基因序列進(jìn)行了分析。這不僅為黔金絲猴保護(hù)和繁育提供參考資料，也為非損傷性取樣在珍稀瀕危野生動(dòng)物研究中應(yīng)用拓寬思路[22]。

以上對(duì)黔金絲猴種群遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)研究表明，由于居住地喪失和片段化已造成種群隔離，使黔金絲猴成為只有一個(gè)連續(xù)群體的物種，具有極低遺傳多樣性。相比之下，川金絲猴在所有金絲猴中分布最廣，滇金絲猴在云南省和西藏自治區(qū)西南部有大約11個(gè)群體。因此，在川、黔、滇3種金絲猴中，黔金絲猴群體增長緩慢，種群恢復(fù)潛力最低，該物種滅絕風(fēng)險(xiǎn)更高[3,16]。由于遺傳多樣性低和種群數(shù)量少，黔金絲猴的進(jìn)一步研究需要在非損傷性取樣基礎(chǔ)上，進(jìn)行較大規(guī)模的線粒體全基因組分析、核分子標(biāo)記開發(fā)或核基因組研究。

4　黔金絲猴基因組學(xué)研究

黔金絲猴的線粒體基因組全序列已測定,在NCBI數(shù)據(jù)庫中有兩個(gè)全序列(JN540032.1 & JQ821836.1)，約為16.5 kb[23-24]。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)黔金絲猴線粒體基因組序列相似度為99%；和人的相似度達(dá)81%，并具有與人線粒體基本一致的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：同樣含13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因；除ND6 亞基基因和8個(gè)tRNA基因位于輕鏈上，其他基因都位于重鏈上[23]。另外，兩個(gè)線粒體全基因組中堿基組成和輕重鏈的化學(xué)特點(diǎn)雖有差異，仍十分相似。其堿基組成和輕鏈、重鏈分子質(zhì)量如表1所示。

表1 黔金絲猴線粒體堿基組成分析

Liedigk等利用線粒體基因組序列和12個(gè)核基因組位點(diǎn)比較分析了3種葉猴(langur)和10種怪鼻猴(odd-nosed monkeys)(包括黔金絲猴)的系統(tǒng)發(fā)生[24]。依據(jù)線粒體數(shù)據(jù)(表2)發(fā)現(xiàn)仰面猴屬(金絲猴屬)與其他怪鼻猴的分異時(shí)間約為728萬年前。對(duì)金絲猴屬而言，首先是越南金絲猴與其他金絲猴分離，分異時(shí)間為237萬年前。隨后是可歸為一支的黔金絲猴和川金絲猴(川-黔金絲猴姊妹群)，與另一支的滇金絲猴和怒江金絲猴(滇-怒金絲猴姊妹群)分異于199萬年前。黔金絲猴和川金絲猴分異時(shí)間是175萬年前，滇金絲猴兩個(gè)單倍型和怒江金絲猴的分異時(shí)間在24～60萬年前。依據(jù)12個(gè)核基因座數(shù)據(jù)表明，首先可能是姊妹群之一的川-黔金絲猴姊妹群與其他金絲猴(滇、怒江、越南金絲猴)分異于169萬年前，然后黔金絲猴和川金絲猴分異時(shí)間于131萬年前。越南金絲猴與滇-怒金絲猴姊妹群分異約在73萬年前，隨后是滇金絲猴和怒江金絲猴分異于22～40萬年前(表2)。以上線粒體數(shù)據(jù)和核基因組數(shù)據(jù)既呈現(xiàn)出大致相似的進(jìn)化趨勢，又存在著相當(dāng)顯著的差異。比如：1)黔金絲猴和川金絲猴形成進(jìn)化一支(川-黔金絲猴姊妹群)，而滇金絲猴和怒江金絲猴歸為一支(滇-怒金絲猴姊妹群)，由線粒體基因組與有限的基因座的分析結(jié)果是吻合的； 2)越南金絲猴的歸屬在兩種分析中差異很大，導(dǎo)致越南金絲猴在兩種分析中處于不同進(jìn)化位置；3)由線粒體數(shù)據(jù)估計(jì)的分異時(shí)間遠(yuǎn)早于核基因數(shù)據(jù)，如黔金絲猴和川金絲猴分異時(shí)間分別為175萬年(線粒體數(shù)據(jù))和131萬年前(核基因組數(shù)據(jù))。

我們利用NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的幾種金絲猴所有線粒體基因組序列進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，兩種黔金絲猴的線粒體基因組差異最??；黔金絲猴與川金絲猴最接近；滇金絲猴與怒江金絲猴或緬甸金絲猴較近；越南金絲猴與以上4種金絲猴的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這與上文基于線粒體分析的結(jié)果一致。另外發(fā)現(xiàn)一個(gè)滇金絲猴數(shù)據(jù)與怒江金絲猴的更接近。這顯示滇金絲猴和怒江(緬甸)金絲猴間更為相近以及兩種金絲猴之間存在的基因交流。

除了開展線粒體全基因組研究，黔金絲猴核基因組全序列也已被測定。最近Zhou等對(duì)4種金絲猴的38個(gè)個(gè)體作了全基因組測序，其中包括4只黔金絲猴[25]；Yu等也對(duì)5種金絲猴進(jìn)行全基因組測序，并做了和Liedigk 等類似的聚類分析[26]。鄰接樹法分析表明黔金絲猴和川金絲猴親緣較近，形成了川-黔姊妹群；滇金絲猴和怒江(緬甸)金絲猴較近，形成了滇-怒姊妹群。與Liedigk等[24]的核基因組位點(diǎn)結(jié)果基本一致，與我們圖1中線粒體的結(jié)果大體一致，只是推測的分異時(shí)間有差別(表2)。

表2 金絲猴各個(gè)種群間的分異時(shí)間

圖1 5種金絲猴(11個(gè)個(gè)體)的線粒體基因組聚類分析

Fig 1 Cluster analysis of mitochondrial genomes about fiveRhinopithecus(11 individuals)

基于NCBI的線粒體全基因組序列分析構(gòu)建了如上系統(tǒng)發(fā)育樹，其中共包括11條序列，黔金絲猴2個(gè)，滇金絲猴3個(gè)，怒江(緬甸)金絲猴1個(gè)，川金絲猴3個(gè)，越南金絲猴2個(gè)；序列號(hào)顯示在圖1括號(hào)中，越南金絲猴進(jìn)化上比較古老，其次為黔金絲猴，川金絲猴等；一條滇金絲猴的線粒體序列和怒江金絲猴的相似度最高

綜合以上數(shù)據(jù)，我們構(gòu)建了黔金絲猴與其他金絲猴的種系發(fā)育的兩種可能模型(圖2)，與王曉萍的分析部分一致[26]。線粒體數(shù)據(jù)表明越南金絲猴在較早時(shí)期便與其他金絲猴分異，是較為古老的種，其次是川-黔金絲猴姊妹群與怒-滇金絲猴姊妹群的分異(圖2-A)。核基因組數(shù)據(jù)除了對(duì)于越南金絲猴進(jìn)化地位的認(rèn)知與線粒體數(shù)據(jù)截然不同外，對(duì)黔金絲猴與其他3種金絲猴的種系發(fā)育關(guān)系認(rèn)知基本一致。顯示川金絲猴和黔金絲猴親緣較近，而滇金絲猴和怒江金絲猴較近；但越南金絲猴居于川-黔金絲猴姊妹群和滇-怒金絲猴姊妹群間(圖2-B)。由于線粒體的母系遺傳特性，線粒體在不同種群間保持一定獨(dú)立性，其數(shù)據(jù)可能揭示曾經(jīng)發(fā)生的分異事實(shí)；而核基因組數(shù)據(jù)中越南金絲猴地位的變化可能反映了怒江(緬甸)甚至滇金絲猴與越南金絲猴發(fā)生了一定程度的種群間雜交導(dǎo)致基因交流，最后使其序列同源性相近因而聚類分析靠近的現(xiàn)象。如果要得到更科學(xué)的結(jié)論，除了要適當(dāng)增加樣本量，并充分考慮種群間存在基因交流情況外，還要開發(fā)更精確的估算方法，解決線粒體數(shù)據(jù)和核基因組數(shù)據(jù)差異較大(包括估算分異年代)的問題。

圖2 基于線粒體和核基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建的仰鼻猴屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

A：基于線粒體序列構(gòu)建的仰鼻猴屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，顯示川金絲猴和黔金絲猴親緣較近(川-黔金絲猴姊妹群)，而滇金絲猴和怒江金絲猴較近(滇-怒金絲猴姊妹群)；而越南金絲猴進(jìn)化上來說相對(duì)較為古老。B：基于核基因組序列，同樣顯示川金絲猴和黔金絲猴親緣較近，而滇金絲猴和怒江金絲猴較近；但是越南金絲猴居于川-黔金絲猴姊妹群和滇-怒金絲猴姊妹群之間，黔金絲猴從進(jìn)化上來說相對(duì)較為古老

由于地質(zhì)事件、氣候變化、地理隔離等原因造成金絲猴不同地理區(qū)域分布，使不同金絲猴種成為研究物種演化、環(huán)境適應(yīng)的良好材料， 也成為研究基因功能、生物醫(yī)學(xué)如腫瘤等研究的動(dòng)物。因?yàn)樵谀[瘤發(fā)展過程中，會(huì)形成低氧微環(huán)境，從而誘導(dǎo)或穩(wěn)定一些低氧誘導(dǎo)因子；而高原生物在長期進(jìn)化中適應(yīng)高原低氧低壓環(huán)境，激活了與腫瘤中部分相似的信號(hào)通路。Yu等比較了低緯度生活的黔金絲猴、越南金絲猴(海拔2000 m以下)和高緯度(海拔3000 m以上)生活的其他3種金絲猴，發(fā)現(xiàn)高緯度金絲猴中，在6個(gè)和肺功能、DNA修復(fù)、血管再生的基因中，有8個(gè)共有的堿基替代；功能實(shí)驗(yàn)表明CDT1的變異(Ala537Val)使細(xì)胞抗紫外線輻射能力較強(qiáng)；RNASE4的變異體(Asn89Lys和Thr128Ile)增強(qiáng)了體外實(shí)驗(yàn)中內(nèi)皮管的形成[27]。表明充分利用這一資源，可開展更多醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究。

5　結(jié)語

威脅黔金絲猴生存的因素主要包括遺傳多樣性、環(huán)境因素、適合度等。分子遺傳學(xué)研究已揭示黔金絲猴具有極低遺傳多樣性，群體小及個(gè)體數(shù)量少是一個(gè)重要原因。其他研究也顯示，黔金絲猴在食性、生境分布上比其他金絲猴更狹窄，在生育周期上比其他種更長。加之?dāng)?shù)量少造成的近親交配會(huì)讓黔金絲猴進(jìn)一步喪失遺傳多樣性，導(dǎo)致生存力日漸衰退，適合度降低。環(huán)境因素包括森林火災(zāi)等自然災(zāi)害、人類活動(dòng)如過度放牧、森林資源采集等。2013年建成的環(huán)梵凈山公路，會(huì)使游人數(shù)量增加，加劇保護(hù)區(qū)的島嶼效應(yīng)和生境破碎化。這些環(huán)境因素的變化目前雖尚未造成嚴(yán)重的影響，但必然是以黔金絲猴為旗艦物種的森林生態(tài)系統(tǒng)的不利因素，需給予高度關(guān)注。

遺傳多樣性貧乏和狹小地理分布現(xiàn)狀，對(duì)黔金絲猴生存和發(fā)展極為不利，但這并非意味著將來該物種必然滅絕。因此，加強(qiáng)對(duì)梵凈山黔金絲猴的研究與保護(hù)極為必要。我們建議：1)采用遺傳管理的方法進(jìn)行拯救，并對(duì)人工圈養(yǎng)的黔金絲猴，分析遺傳多樣性情況，在繁殖中優(yōu)先考慮有差異或差異大個(gè)體的基因，以最大限度維持圈養(yǎng)群體遺傳多樣性；2)各自然保護(hù)區(qū)、各研究金絲猴團(tuán)隊(duì)彼此間應(yīng)加強(qiáng)合作，共建網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，共享信息；3)鑒于怒江(緬甸)金絲猴的跨區(qū)域分布，加強(qiáng)與東盟成員國尤其是緬甸和越南合作，共同保護(hù)金絲猴棲息環(huán)境，展開國際合作研究；4)從技術(shù)層面，應(yīng)加強(qiáng)基因組學(xué)方面研究，尤其是利用少量細(xì)胞高通量測序技術(shù)，獲得更多個(gè)體遺傳資料, 了解并保護(hù)黔金絲猴及其他金絲猴的遺傳多樣性，避免金絲猴不同種群部分或全部滅絕的命運(yùn)。

致謝：感謝云南大學(xué)于黎教授閱讀該文并提出的寶貴意見。

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