何天慈, 萬建青, 鄒興啟, 李 翠, 朱元源, 徐 嫄, 趙啟祖

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所, 北京 海淀100081)

由豬圓環(huán)病毒(PCV)引起的豬圓環(huán)病毒病(PCVD)已成為繼豬繁殖與呼吸綜合征之后新發(fā)現(xiàn)的豬的重要傳染病[1],PCVD 成為2010 年國際豬獸醫(yī)大會最受關(guān)注的疫病之一[2]。 目前,十分確定的是豬圓環(huán)2 型病毒(PCV2)與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征、皮炎和腎病綜合征、仔豬先天性震顫、壞死性增生性肺炎、豬呼吸道綜合征、母豬繁殖障礙等多種疾病相關(guān),所以防控PCV2 的感染成為了養(yǎng)豬業(yè)的重中之重。 疫苗免疫接種被認(rèn)為是防控PCVD的有效手段,商品化疫苗的推廣應(yīng)用為有效防控中國PCV2 疫情發(fā)揮了重要作用[3]。

1 國內(nèi)商品化PCV2 疫苗種類及基本情況

PCV2 疫苗于2006 年研制成功,國內(nèi)A 公司率先推出全病毒滅活苗( SH 株),后來有LG 株、DBN -SX07 株、WH 株、ZJ /C 株疫苗陸續(xù)被批準(zhǔn)上市[2],截至2017 年8 月23 日,國內(nèi)商品化PCV2 疫苗已有10種,其中8 種為國產(chǎn)疫苗,2 種為進(jìn)口疫苗,分別由32家國內(nèi)企業(yè)和兩家進(jìn)口企業(yè)生產(chǎn)[4],見表1。

2 國內(nèi)商品化PCV2 疫苗效力檢驗方法基本情況

國內(nèi)商品化PCV2 疫苗眾多,據(jù)農(nóng)業(yè)部公告(第1448號文件等可知)不同廠家所產(chǎn)疫苗采用的效力檢驗方法也不相同,如表2,免疫攻毒法經(jīng)典卻耗時耗力,免疫試驗法相對縮短了時間,而抗原含量檢測法用時更短,成本也大大降低。 但每種方法的具體檢測法也不同,這種差異就會影響疫苗質(zhì)量的判定結(jié)果。 下面作者將概述國內(nèi)商品化PCV2 疫苗的效力檢驗方法,以進(jìn)行比較。

表1 國內(nèi)商品化豬圓環(huán)病毒2 型疫苗及其基本情況

2.1 免疫攻毒檢驗法 上述10 種疫苗效力檢驗方法均為二選一,每種疫苗均涉及到了免疫攻毒檢驗,檢測抗原的方法存在較大差異,主要有兩處不同。

2.1.1 實驗動物的種類及日齡 實驗動物有BALB/c 小鼠和陰性仔豬兩種。

研究表明,自然條件下,BALB/c 小鼠不會感染PCV2,篩選PCV2 抗原和抗體雙陰性的小鼠較容易[5]。 此外,BALB/c 小鼠已被證實可人工感染PCV2,病毒能在體內(nèi)復(fù)制增殖,產(chǎn)生特征性病理變化和臨床癥狀[6]。 董林等[7]以BALB/c 小鼠為動物模型,對疫苗免疫ELISA 抗體水平、攻毒后臨床癥狀、病理變化、PCV2 核酸載量等指標(biāo)進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,不同免疫劑量和免疫途徑能顯著影響PCV2 特異性抗體水平,攻毒后PCV2 感染小鼠出現(xiàn)了消瘦、腹瀉、精神緊張臨床癥狀和淋巴細(xì)胞腫大,肺臟、脾臟出血和腎臟水腫等特征性PCVD 病理變化,于攻毒后11 d 出現(xiàn)特征性稽留熱,體溫升高1 ℃,并持續(xù)4 d,疫苗免疫組僅出現(xiàn)低于1 ℃的體溫升高,不同組織中PCV2 核酸載量檢測結(jié)果證明,PCV2 感染有趨淋巴結(jié)特性。 但因小鼠自身體重的限制及其生長特性等生理指標(biāo)與豬可能存在較大不一致性,該數(shù)據(jù)與以豬為實驗動物的相關(guān)檢測數(shù)據(jù)存在一定差異性,還需進(jìn)一步試驗數(shù)據(jù)的支撐。

表2 國內(nèi)商品化PCV2 疫苗效力檢驗方法

豬是PCV2 主要易感動物,除了ZJ/C 株滅活疫苗同時涉及小鼠和豬兩種實驗動物,其余9 種疫苗均以豬作為實驗動物。 有專家通過超聲影像引導(dǎo),將PCV2 經(jīng)腹腔注射到子宮,建立了以宮內(nèi)感染PCV2 試驗豬模型,以此評價PCV2 對母豬繁殖的影響,也有專家觀察仔豬與病豬直接接觸而感染PCV2 的平均感染時間為18.4 d,建立了PCV2 感染與時間相關(guān)的模型[2]。 董信田等[1]在試驗中對實驗動物攻毒后,攻毒對照豬體重有所降低,免疫豬和空白對照豬平均體重升高,說明PCV2 疫苗能夠?qū)ωi體產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)作用,并提出平均日增重是評價PCV2 疫苗對豬體保護(hù)程度的一個很重要的指標(biāo)。 國內(nèi)有4 種疫苗采用豬免疫攻毒檢驗法進(jìn)行效力檢驗時,將相對日增重納入了判定標(biāo)準(zhǔn)。

但是,PCV2 疫苗臨床接種率逐年上升,2017 年已達(dá)98.12%,獲得雙陰性仔豬的成本較大。 此外,10 種疫苗中有6 種疫苗使用14 ～21 日齡的陰性仔豬,另外4 種疫苗分別采用了14 ～28 日齡、21 ～28日齡、21 ～35 日齡和30 ～40 日齡的陰性仔豬。 日齡不同,其機(jī)體免疫系統(tǒng)完善程度不同,免疫應(yīng)答水平則存在差異[18],進(jìn)而影響疫苗評估的一致性。

2.1.2 病原檢測法 盡管對免疫攻毒動物的組織進(jìn)行病原檢測是圓環(huán)疫苗的重要手段,但方法有所不同,在我國已批準(zhǔn)的圓環(huán)疫苗中,ZJ/C 株和LG 株分別采用了間接免疫熒光法和熒光定量PCR 檢測病原,其余8 種疫苗均采用了免疫組化方法檢測抗原,SH 株、SH II 株和DBN-SX07 株也進(jìn)行了體溫或相對日增重的測量,WH 株和CP08 株采用PCR 法檢測病毒血癥,對疫苗的效力檢測進(jìn)行了補充,而1010 株疫苗進(jìn)行效力檢驗時不僅運用了免疫組化法檢測抗原,還用實時熒光定量PCR 測定了病毒核酸數(shù)量,同時進(jìn)行了液相阻斷ELISA 檢測抗體和測量相對日增重,從多方面進(jìn)行評價。

2.1.2.1 間接免疫熒光檢測技術(shù)(IFA) Allan等[9]曾用IFA 檢測組織、細(xì)胞培養(yǎng)物中的PCV。 該法操作快捷、簡單、成本低,應(yīng)用較廣泛,但該法用于疫苗評估時需應(yīng)用病毒分離及培養(yǎng)技術(shù),若所用細(xì)胞不適宜病毒的生長,病毒滴度則會降低。

2.1.2.2 免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC) IHC 定位準(zhǔn)確、特異性強、操作簡單,檢測成本低,對試驗條件要求不高,是許多實驗室首選的檢測手段[10]。 唐寧[11]等將PCV2 BF 株經(jīng)滴鼻接種28 日齡健康仔豬,于接種后不同時間剖殺并采集相關(guān)器官組織制備組織切片,用該法檢測病毒在豬體內(nèi)的分布。 但該法仍具有局限性,抗體濃度不當(dāng)、抗體本身達(dá)不到應(yīng)有的敏感度、標(biāo)本處理不當(dāng)或標(biāo)本抗原含量少,都會造成假陰性[12],而且,該法繁瑣、耗時長,所使用的二甲苯具有致畸性和致癌性。

2.1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) PCR 敏感性強,常用于篩選抗原陰性動物和檢測病料。 Larochelle 等[13]用多重PCR 方法檢測1997 -1998 年間的42 份病料發(fā)現(xiàn)40 份PCV2 陽性,1 份PCV1 陽性,1 份PCV1 和PCV2 混合感染。 徐朋麗等[14]建立了PCV 2/3 型雙重PCR 檢測方法,檢測176 份病料時發(fā)現(xiàn)無PCV 3 單獨感染樣品,并推測PCV 3 易與PCV 2 混合感染。 但該法不能量化核酸,只要待測樣品中含有微量的特定DNA 片段即可檢測為陽性,無法判定病毒血癥的嚴(yán)重程度。 羅玉均[15]等人成功建立了Taqman 探針熒光定量PCR 方法,為PCV2 的研究提供了先進(jìn)的檢測技術(shù),并提出,對于病毒的含量和疾病發(fā)生的相關(guān)性研究,以及對PCV2 的監(jiān)測等研究均可用此法獲得準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)。 但該法只能相對定量,仍需具有豐富經(jīng)驗的人員操作,給生產(chǎn)企業(yè)成品疫苗質(zhì)量控制實施過程造成很大困擾[16]。

2.2 免疫抗體水平檢測 上述10 種疫苗中有5 種疫苗采用了免疫試驗,豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗(SH 株)和豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗(SH 株,II)采用了小鼠免疫試驗,豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗(LG株)、豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗(WH 株)和豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗(DBN-SX07 株)采用了仔豬免疫試驗。 5 種疫苗中只有LG 株采用IPMA 法檢測抗體水平,另4 種則采用ELISA 法檢測。

2.2.1 免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(IPMA) IPMA 具有特異、敏感、操作簡單、實用性強等特點。劉長明等[17]建立并優(yōu)化的IPMA 可用于PCV2 血清抗體檢測。 潘曉梅等[18]用其實驗室建立的IPMA法與已有的ELISA 法對135 份豬血清進(jìn)行平行試驗,發(fā)現(xiàn)IPMA 法檢測樣品中有73 份呈陽性和62份呈陰性,而ELISA 法檢測有87 份呈陽性和48 份呈陰性,采用IPMA 法檢測ELISA 陽性樣品,其中陰性者有14 份;檢測ELISA 陰性樣品,其中陽性者有2 份,兩種方法檢測均為陽性者73 份,均為陰性者46 份,總符合率為88.15%。 該法所用的條件實施較為普遍,結(jié)果判定只需在普通顯微鏡下觀察即可,但實際操作者需具有一定的經(jīng)驗,才能保證結(jié)果判定的準(zhǔn)確性。

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) ELISA 速度快、敏感性強,是檢測血清中抗體水平的常用方法之一。 PCV2 疫苗對于豬的有效保護(hù)性依賴于主動誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫而獲得特異性抗體。 特定的免疫應(yīng)答在接種后的2 ～3 周形成,機(jī)體血清中抗體水平的變化和持續(xù)時間的長短及離散性,是反映疫苗免疫效力的重要指標(biāo)[2],因此,國內(nèi)PCV2 滅活疫苗效力檢測方法大多為ELISA 檢測血清抗體水平,而且該類試劑盒已商業(yè)化,被廣泛運用。 然而,吳華偉等[19]對國內(nèi)5 個廠家生產(chǎn)的5 種PCV2 抗體檢測試劑盒進(jìn)行了敏感性、特異性和符合率測定,并比較了試劑盒間的符合率,發(fā)現(xiàn)5 個PCV2 抗體檢測試劑盒特異性檢測結(jié)果均在90%左右,但敏感性差異較大,且各試劑盒間檢測結(jié)果的符合率較差,僅為63.2%,總體來看,國產(chǎn)PCV2 抗體檢測試劑盒質(zhì)量參差不齊,僅2 個試劑盒適合用于PCV2抗體檢測。

2.3 疫苗抗原含量檢測 Cinzia Zanotti 和Massimo Amadori[20]于2015 年利用蔗糖梯度離心和分光光度法原理將豬圓環(huán)2 型病毒抗原量化,探索了PCV2抗原含量與紫外吸收峰面積的相關(guān)性,建立了一種PCV2 全病毒粒子的檢測方法,并建議采用該方法檢測豬圓環(huán)疫苗的批次一致性。 然而,國內(nèi)只有4種商品化PCV2 滅活疫苗的效力檢驗方法涉及到疫苗抗原含量的測定,使用的方法分別為瓊脂擴(kuò)散試驗、Cap 蛋白含量測定、夾心ELISA 法和相對效力檢驗法。

瓊脂擴(kuò)散試驗為可溶性抗原與相應(yīng)抗體在含有電解質(zhì)的半固體凝膠中進(jìn)行的一種沉淀試驗。朱瑩瑩[21]等人發(fā)現(xiàn),PCV2 Cap 蛋白原核表達(dá)工程菌表達(dá)產(chǎn)物中總蛋白含量為0.255 ～0.857 mg/mL區(qū)間內(nèi),蛋白含量與瓊脂雙向免疫擴(kuò)散試驗抗原滴度成正相關(guān)關(guān)系。 該方法操作簡單,但結(jié)果為肉眼觀察,判定標(biāo)準(zhǔn)會因人而異。

Cap 蛋白含量測定是利用BCA 法檢測樣品總蛋白含量,同時進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白電泳,并分析目的條帶在總蛋白中的濃度,代入公式計算Cap 蛋白含量。 該方法計算簡便,但對蛋白純化技術(shù)及儀器設(shè)備要求較高。

夾心ELISA 法簡便、快速、敏感性高,該方法不僅能用于抗原的定性檢測,還可進(jìn)行定量分析,因此具有重要的應(yīng)用價值。 McNeilly[22]等首先建立的PCV2 抗原捕獲ELISA 方法。 翟淑燕[23]建立的夾心ELISA 抗原檢測方法采用了“四參數(shù)邏輯擬合”免疫檢測方式,繪制四參數(shù)曲線,其相關(guān)系數(shù)R 值為0.99,該曲線可比較精確的反映抗原濃度和吸光度的曲線關(guān)系,從而準(zhǔn)確計算出樣品中的PCV2 抗原含量。 楊利等[24]采用重組抗PCV2b 納米抗體作為捕獲抗體,鼠抗PCV2b 單克隆抗體為檢測抗體,建立了定量檢測PCV2b 的夾心ELISA 方法。 該方法不僅能夠用于豬圓環(huán)疫苗中PCV2b 抗原的檢測,還可用于大腸桿菌或桿狀病毒表達(dá)的PCV2b 衣殼蛋白(Cap)亞單位疫苗的檢測,且與其他豬病毒無交叉反應(yīng)。

相對效力檢驗法是以ELISA 原理為基礎(chǔ)的疫苗抗原檢測方法,但需要參考疫苗做對比,最后計算RP 值。 上述10 種疫苗中,只有豬圓環(huán)病毒2 型桿狀病毒載體滅活疫苗(CP08 株)和豬圓環(huán)病毒2型桿狀病毒載體滅活疫苗采用了該方法,該方法既敏感、快捷、簡便,也替代了動物實驗,用時只有2天,省時省力。

3 總結(jié)

國內(nèi)PCV2 疫苗生產(chǎn)企業(yè)和生產(chǎn)量逐年增加[25],PCV2 疫苗臨床接種率逐年上升,2017 年已達(dá)98.12%,截止2018 年3 月19 日,已簽發(fā)疫苗再添豬圓環(huán)病毒2 型基因工程亞單位疫苗(大腸桿菌源),豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗(YZ 株)也獲得了批準(zhǔn)文號[4]。 然而,不同生產(chǎn)廠家采用著不同實驗室方法來確定PCV2 疫苗的效力,未統(tǒng)一方法和標(biāo)準(zhǔn)。PCV2 疫苗接種后均無繁殖過程,因而必須有足夠的抗原量作保證,才能刺激機(jī)體產(chǎn)生堅實的免疫力[26],然而,只有4 種采用疫苗抗原含量測定方法來評估疫苗效力,方法和判定標(biāo)準(zhǔn)也不統(tǒng)一。 王曉卉[27]建立了定量檢測PCV2 滅活苗參考品的熒光定量PCR 方法,并證明了直接檢測疫苗破乳水相中的病毒核酸拷貝數(shù)與小鼠免疫試驗法具有很好的相關(guān)性。 但該方法只能用與全病毒疫苗的測定,不適用于基因工程亞單位疫苗。 Cap 蛋白是豬圓環(huán)病毒唯一的結(jié)構(gòu)蛋白,具有免疫原性,因此,可嘗試探索一種準(zhǔn)確檢測疫苗中Cap 蛋白含量的方法,并確定該方法與常規(guī)疫苗效力檢驗方法或靶動物攻毒保護(hù)力之間的相關(guān)性,那么這種操作簡單、方便快捷的方法將可能替代常規(guī)疫苗效力檢驗方法,不再依賴實驗動物,避免了實驗動物本身的差異對效力檢驗的影響,這不僅省時省力,降低成本,減少了獲得陰性動物的困難,還尊重了動物試驗的“3R”理論。