張 博

(撫順市動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧撫順 113006)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是家豬和野豬感染的一種病毒性傳染病，其病原是能夠引起豬出血熱的非洲豬瘟病毒(African swine fever virus ,ASFV)。根據(jù)ASFV的特性、臨床癥狀和感染途徑，該病分為能夠長期持續(xù)性感染的慢性感染和病死率達(dá)100%的急性感染。高致病性ASFV毒株感染的臨床表現(xiàn)包括高熱、精神沉郁、皮膚發(fā)紺、食欲廢絕、出血性病變和共濟(jì)失調(diào)，并伴有嚴(yán)重的血小板和淋巴細(xì)胞減少，感染動物通常在感染后10 d～14 d內(nèi)死亡[1]。

ASF在非洲大陸的豬群中流行傳播已有幾十年，而且殃及到西班牙、葡萄牙、法國和意大利等歐洲國家的豬群，但在20世紀(jì)90年代中期，除了撒丁島，該病在歐洲的其他國家已被凈化[2]。雖然撒丁島采取了與西班牙和葡萄牙等歐洲國家相類似ASF凈化措施，但是由于當(dāng)?shù)氐纳鐣幕?、?jīng)濟(jì)發(fā)展和生產(chǎn)因素使ASF在撒丁島的凈化效率受到影響[3]。2007年，ASF通過高加索地區(qū)，特別是格魯吉亞，重新傳入歐洲大陸，并由此傳播到亞美尼亞、俄羅斯、白俄羅斯、烏克蘭以及波蘭和立陶宛[4-5]。由于疫苗和抗病毒藥物的缺乏，非洲豬瘟對所有歐洲國家構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。

盡管世界各國對ASFV疫苗進(jìn)行了深入研究，但目前并未產(chǎn)生疫苗可以有效地預(yù)防ASF的全球性傳播。本文旨在介紹當(dāng)前ASFV疫苗和抗病毒藥物的研究現(xiàn)狀，總結(jié)了過去幾十年來對有效疫苗開發(fā)的研究成果。此外，還討論了如抗病毒化合物等其他替代方法，該類化合物由于ASF全球化威脅性的日益嚴(yán)重而備受關(guān)注。同時(shí)，重點(diǎn)介紹了疫苗開發(fā)和抗病毒藥物研究的一些先進(jìn)觀點(diǎn)。

1 疫苗

大多數(shù)病毒疫苗都采用兩種不同的制備方法，即病毒滅活和病毒弱化。其中，滅活疫苗的主要缺點(diǎn)是，由于物理或者化學(xué)因素滅活，導(dǎo)致疫苗產(chǎn)生免疫反應(yīng)的時(shí)間不長，與此相反，弱毒疫苗能夠引起強(qiáng)烈且長時(shí)間的免疫反應(yīng)[6]。目前，可以采用基因敲除、反向遺傳學(xué)和基因重組等策略提高弱毒疫苗的有效性[7]。

生產(chǎn)安全有效的ASFV疫苗始于20世紀(jì)60年代中期，當(dāng)時(shí)研究人員發(fā)現(xiàn)通過細(xì)胞傳代培養(yǎng)的弱化ASFV可以誘導(dǎo)產(chǎn)生豬源抗體，而且同源性ASFV無法對血清中帶有該抗體的豬引發(fā)急性病變。據(jù)報(bào)道，將感染ASFV的戊二醛固定的肺泡巨噬細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞聲波破碎后，再免疫給豬，這些豬在受到強(qiáng)毒株感染時(shí)，會加速血清學(xué)反應(yīng)[8]。此外，豬感染無紅細(xì)胞吸附力的非致死性ASFV之后，表現(xiàn)出對高致病毒株ASFV/l60的抗性增加，并在感染的情況下存活了下來，且沒有明顯改變。豬在免疫接種無毒性的OURT88/3毒株之后，再用關(guān)系密切的強(qiáng)毒株OURT88/1加強(qiáng)免疫，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生對同一基因型Ⅰ的不同分離株進(jìn)行交叉保護(hù)[9]。由此可以看出，雖然用一個(gè)強(qiáng)毒株進(jìn)行加強(qiáng)免疫不能確保其完全的安全性，但是可以產(chǎn)生具有交叉保護(hù)的ASFV疫苗，從而擴(kuò)大了疫苗接種的方式以及應(yīng)用范圍。

研究表明，用現(xiàn)代佐劑制備的滅活A(yù)SFV可以在豬的體內(nèi)誘導(dǎo)出ASFV特異性抗體。雖然所有的動物都可以產(chǎn)生ASFV特異性抗體，但并沒有觀察到明顯的免疫保護(hù)作用[10]。由此可見，ASFV特異性抗體并沒有顯示其中和活性。然而，大量的證據(jù)表明，豬源抗體可以在體外中和各種ASFV強(qiáng)毒株的傳染性，而中和活性的喪失取決于ASFV在細(xì)胞系中的增殖,并且ASFV的低傳代株和高傳代株在中和反應(yīng)的敏感性上存在差異[11]。

對抗原及其表位的識別可以引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，從而開發(fā)有效的ASFV疫苗。通過研究發(fā)現(xiàn)了一些抗原，比如ASFV特異的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞可以識別并裂解表達(dá)ASFV p30和p72蛋白的細(xì)胞[12]。不同的病毒蛋白在ASFV復(fù)制的過程中發(fā)揮的作用不同，因此p30蛋白的抗體抑制細(xì)胞內(nèi)超過95%ASFV內(nèi)在化，而p72和p54蛋白的抗體能夠抑制病毒附著。通過對p32蛋白和p54蛋白的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，雖然重組p30或p54蛋白可以使豬產(chǎn)生免疫誘導(dǎo)中和抗體，但按照該方法免疫不能保護(hù)急性ASF感染的豬。相比之下，p30和p54這兩種蛋白的結(jié)合體或嵌合體可能會誘導(dǎo)產(chǎn)生對ASFV感染的局部保護(hù)[13]。但也有研究顯示，桿狀病毒表達(dá)的p30、p54和p72免疫依然不能夠使豬免受ASFV感染。以上結(jié)果表明，這些蛋白質(zhì)的抗體不足以形成完全免疫[12]。事實(shí)上，新的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在對抗ASFV時(shí)起到了重要的保護(hù)作用，而帶有衰亡的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的豬對ASFV的感染并沒有保護(hù)作用。但具有可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答的以DNA融合質(zhì)粒和桿狀病毒為載體的疫苗，能夠?qū)SFV的侵襲發(fā)揮部分保護(hù)作用，從而證實(shí)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在疫苗開發(fā)中的重要性[11]。由于上述研究的滅活苗、弱毒苗或者亞單位疫苗都不能對實(shí)驗(yàn)感染的豬進(jìn)行全面保護(hù)，因此，在未來的研究里仍需要研發(fā)有效的疫苗。

2 抗病毒藥物

在沒有抗ASFV疫苗的情況下，價(jià)格合理的抗病毒化合物可產(chǎn)生非常有效的作用，因?yàn)楹侠響?yīng)用抗病毒藥物可延長宿主的存活時(shí)間，并使受感染的豬產(chǎn)生對ASFV的有效免疫反應(yīng)。同時(shí)，在已經(jīng)感染養(yǎng)殖場附近地區(qū)采取抗病毒治療，能夠?qū)Ω腥镜貐^(qū)進(jìn)行隔離，給管理者提供足夠的時(shí)間采取對抗病毒感染的措施。

基于抑制機(jī)理的不同，潛在的抗ASFV化合物可分為兩類：一類是在復(fù)制周期直接作用于ASFV的抑制劑；另一類是針對參與病毒復(fù)制的宿主細(xì)胞因子抑制劑。ASFV的復(fù)制周期包括病毒附著、內(nèi)在化、基因組增殖、子代病毒的組裝和釋放等幾個(gè)步驟。能夠直接或間接地阻斷這些步驟之一的特異性藥物可以成為抑制ASFV感染的潛在工具。

一些研究討論過干擾ASFV早期感染階段的藥物。研究發(fā)現(xiàn)，硫酸多糖會影響ASFV的附著和隨后的復(fù)制，這是因?yàn)橛蓭ж?fù)電荷的硫酸鹽基團(tuán)在病毒包膜上與帶正電的氨基酸相互作用而抑制病毒附著在細(xì)胞上。依賴巨胞飲和網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用是ASFV入侵的下一個(gè)步驟，細(xì)胞膜上的膽固醇與此相關(guān)，因此，膽固醇去除劑如甲基-β-環(huán)糊精可抑制病毒復(fù)制[11]。阿米洛利是潛在的巨胞飲抑制劑，也可以導(dǎo)致明顯的ASFV侵入降低[14]。綜上所述，這些結(jié)果表明，依賴巨胞飲和網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞過程可以作為ASFV入侵的替代或協(xié)同機(jī)制。溶酶體藥物，如氯化銨、金剛烷胺、氯喹和甲胺，阻斷了內(nèi)體酸化，而內(nèi)體酸化是ASFV成功感染的必要條件，從而明顯抑制了病毒的復(fù)制。

在過去的幾十年，發(fā)現(xiàn)了針對ASFV酶的抗病毒藥物。利福霉素衍生物可以抑制依賴DNA的RNA聚合酶和Ⅱ型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶。系統(tǒng)遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶與細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶和Ⅳ型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶相類似，這說明抗菌的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑可能干擾ASFV的復(fù)制。事實(shí)上，喹諾酮類抗菌藥物，可以通過抑制Ⅱ型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶干擾ASFV的復(fù)制周期[15]。

核苷類似物是主要的抗病毒藥物，通過與病毒核酸的結(jié)合或干擾病毒的聚合酶和核糖核苷酸還原酶等關(guān)鍵酶來抑制病毒的復(fù)制。不同的核苷類似物對ASFV的體外活性存在差異。與其他的核苷類似物相比，環(huán)-9-(3-羥基-2-膦酰基甲氧基丙基)腺嘌呤和碳環(huán)3-去氮雜腺苷有更高的抗ASFV活性[16]。此外，在病毒吸附前添加以抗腫瘤活性而聞名的沒食子酸十二酯，可以觀察到其抑制細(xì)胞和病毒DNA的合成和后期的病毒轉(zhuǎn)錄，具有顯著抑制ASFV的復(fù)制的抗病毒效果。

植物是抗病毒治療中許多藥理反應(yīng)的天然產(chǎn)物的來源。海洋微藻的提取物，如紫球藻和后棘藻所產(chǎn)生的硫酸化多糖可以通過劑量依賴型模式抑制ASFV的體外復(fù)制。在原代細(xì)胞培養(yǎng)中，鉤枝藤的提取物和碎片具有抗ASFV的活性[17]。此外，多酚植物抗毒素如白藜蘆醇和氧化白藜蘆醇可以通過抑制病毒DNA復(fù)制和后期病毒蛋白合成來顯著降低ASFV的增殖[4]。 雖然以上提到的化合物都具有很好的抗ASFV活性，但缺乏關(guān)于體內(nèi)試驗(yàn)活性的證據(jù)。因此，需要開展更深入的體內(nèi)研究，證實(shí)這些化合物可能是治療ASFV感染的潛在藥物。

3 展望

ASFV基因的識別將成為ASFV疫苗發(fā)展的切入點(diǎn)，靶基因的缺失可降低病毒毒力或增加免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。兩種相反的方法可以用來鑒別靶基因：一是敲除參與ASFV侵襲和免疫逃避的非必需基因，從而產(chǎn)生弱毒株；二是敲除對ASFV復(fù)制至關(guān)重要的基因，使之不能夠在免疫過的豬體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。一些ASFV基因可以作為敲除目標(biāo)基因的候選基因，例如敲除參與編碼核苷酸代謝酶的ASF基因，包括胸苷激酶和參與病毒形態(tài)變化的ERV 1同系物，這些酶可以參與巨噬細(xì)胞中的病毒復(fù)制[18]。相比之下，刪除一些其他參與免疫逃避的基因雖然并不能降低ASFV的毒性，但這些基因的缺失有助于產(chǎn)生有效的疫苗。例如，病毒蛋白A238L抑制宿主轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和NFAT，以及轉(zhuǎn)錄激活蛋白CBP和p300，從而影響這些因素所控制的免疫調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄激活[19]。此外，ASFV編碼的2個(gè)基因CDv2和EP153R，可以分別抑制受感染細(xì)胞的識別和對MHCⅠ類多肽的表達(dá)[16,20]。由于這些蛋白可能會干擾宿主的免疫反應(yīng)，因此從弱毒和強(qiáng)毒的ASFV株中敲除相應(yīng)基因可能會增強(qiáng)免疫反應(yīng)。

雖然將由基因敲除毒株產(chǎn)生的重組ASFV疫苗接種給豬，可以防止其被親本病毒感染，但是敲除其他基因并不會誘導(dǎo)豬產(chǎn)生保護(hù)性免疫[18,21]。因此，需要通過進(jìn)一步的研究來確定最合適的靶向敲除基因。此外，豬接種天然弱毒苗之后會出現(xiàn)發(fā)燒等不良反應(yīng)[22]，基于這種現(xiàn)象，研究者還需要了解關(guān)于使用ASFV弱毒株誘導(dǎo)發(fā)生保護(hù)性免疫反應(yīng)時(shí)，避免副反應(yīng)發(fā)生的相關(guān)知識。

目前已知，歐洲野豬的數(shù)量與包括發(fā)生在高加索和俄羅斯聯(lián)境內(nèi)的幾次ASF暴發(fā)有關(guān)。因?yàn)椋柏i能夠通過直接接觸家豬、攝入污染物和被感染的尸體促進(jìn)該病的傳播，從而使對ASFV的控制措施變得更加復(fù)雜[8]。在ASF流行地區(qū)免疫口服苗可能是一種可行的控制措施，這種方法被證實(shí)可以有效地控制動物結(jié)核和偽狂犬病等疾病[23]，因此，應(yīng)將口服苗作為野豬免疫的候選疫苗，并對其進(jìn)行適用性評估。

此外，通過對ASFV復(fù)制周期和致病機(jī)制中涉及的過程進(jìn)行研究可以為抗病毒藥物的設(shè)計(jì)提供新的指向，例如，近年的研究發(fā)現(xiàn)，ASFV利用了網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用和巨胞飲作用來感染宿主細(xì)胞[24]。兩種機(jī)制都需要病毒和宿主細(xì)胞膜的融合以達(dá)到成功感染，而這兩層膜的融合是熱感的，它具有非常高的動能屏障，病毒融合蛋白可以通過減少各種動能屏障來加速膜融合過程[24]?；趯SFV融合蛋白結(jié)構(gòu)的分析，該蛋白可能有助于以融合蛋白為靶向的抗病毒藥物的發(fā)現(xiàn)。此外，高通量篩選方法可識別抗ASFV化合物，這些化合物可通過生物化學(xué)或生物物理機(jī)制來增加動力學(xué)屏障，從而抑制ASFV與宿住細(xì)胞膜的融合。

ASFV關(guān)系到豬養(yǎng)殖業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)效益，因此解決ASFV問題刻不容緩。雖然目前已經(jīng)對實(shí)驗(yàn)疫苗、細(xì)胞培養(yǎng)的弱毒苗或轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)產(chǎn)生的重組苗都進(jìn)行了研究和評估，但尚未研發(fā)出具有高免疫原性和全面免疫保護(hù)效果的疫苗。因此，堅(jiān)持研究ASFV與宿主細(xì)胞的相互作用，會給疫苗研制和抗病毒藥物的研究提供新的思路。即使不能完全的消滅ASF，單獨(dú)使用疫苗或?qū)⒁呙绾涂共《舅幬锫?lián)合使用將減弱ASFV的致病性。