譚 偉，黃 莉，謝芝勛

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001)

禽呼腸病毒(Avian reovirus,ARV)是沒有囊膜、分節(jié)段的雙鏈RNA病毒,病毒粒子以對(duì)稱的二十面體形式存在，直徑約為70 nm～80 nm,成熟的病毒顆粒內(nèi)含有呈線性排列且由10個(gè)雙鏈RNA基因節(jié)段組成的病毒基因組[1]。病毒的10個(gè)RNA基因片段可分為3類，即L(Large)類、M(Middle)類和S(Small)類。L類RNA的分子質(zhì)量較大，包括病毒基因片段L1、L2和L3。M類RNA的分子質(zhì)量中等，含有基因片段M1、M2和M3。S類RNA基因的分子質(zhì)量較小，由S1、S2、S3和S4共4種RNA分子所組成[1]。ARV的10個(gè)RNA基因片段可以編碼病毒的8種結(jié)構(gòu)蛋白(λA、λB、λC、μA、μB、σA、σB和σC)及4種非結(jié)構(gòu)蛋白(μN(yùn)S、σNS、p10和p17)[2]。其中，S1基因片段的結(jié)構(gòu)比較特殊，含有3個(gè)相互重疊的基因編碼區(qū)，可利用不同的翻譯機(jī)制分別合成3種蛋白，即非結(jié)構(gòu)蛋白p10、p17和結(jié)構(gòu)蛋白σC。本文著重介紹禽呼腸病毒S1基因編碼蛋白的合成機(jī)制。

1 真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成機(jī)制

與其他病毒一樣，ARV也必須借助于易感細(xì)胞內(nèi)的蛋白翻譯體系合成病毒自身的蛋白[2]。真核細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的機(jī)制主要包括核糖體掃描翻譯機(jī)制、漏過掃描機(jī)制、重新啟動(dòng)翻譯機(jī)制及核糖體分路翻譯機(jī)制及內(nèi)部起始翻譯機(jī)制等[3-4]，不依賴于mRNA。為了便于理解ARV的S1基因片段合成病毒蛋白的機(jī)制，下面扼要介紹真核細(xì)胞內(nèi)蛋白合成的幾種常見形式。

1.1 核糖體掃描翻譯機(jī)制

真核細(xì)胞中的mRNA多數(shù)以單順反子存在，主要通過依賴于mRNA 5′末端帽狀結(jié)構(gòu)的核糖體掃描翻譯機(jī)制來合成蛋白。一般認(rèn)為，核糖體40 S小亞基首先與多個(gè)蛋白翻譯起始因子相互作用，然后和mRNA 的5′末端帽狀結(jié)構(gòu)結(jié)合，并沿著mRNA鏈以線性方式，從5′末端向3′末端移動(dòng)，當(dāng)遇到第一個(gè)蛋白翻譯起始密碼子AUG時(shí)，核糖體40 S小亞基與60 S大亞基結(jié)合形成80 S復(fù)合物，從而啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯[5]。

1.2 漏過掃描機(jī)制

當(dāng)離mRNA 5′末端帽狀結(jié)構(gòu)最近的AUG所處的堿基序列環(huán)境欠佳時(shí)，也就是說與最佳的Kozak序列(A-3CCAUGG+4)有較大差別時(shí)，部分40 S小亞基會(huì)滑過這個(gè)AUG，繼續(xù)向mRNA的3′末端移動(dòng)，直到遇上合適的蛋白翻譯起始密碼子時(shí)才啟動(dòng)翻譯[3,6]。

1.3 重新啟動(dòng)翻譯機(jī)制

當(dāng)mRNA含有的第1個(gè)蛋白翻譯開放閱讀框(open reading frame,ORF)ORF1翻譯結(jié)束后，核糖體可以繼續(xù)沿著mRNA 向3′末端移動(dòng)，若遇上ORF2中適宜的AUG密碼子，則可啟動(dòng)ORF2的翻譯。重新啟動(dòng)翻譯有兩個(gè)必要條件：①ORF1的長(zhǎng)度應(yīng)小于30個(gè)密碼子，以避免丟失過多的蛋白翻譯起始因子；②ORF1與ORF2之間的距離應(yīng)大于70個(gè)核苷酸，以使移動(dòng)的40 S小亞基有足夠的時(shí)間重新結(jié)合蛋白翻譯所需的各種必要因子[7]。

1.4 內(nèi)部啟動(dòng)翻譯機(jī)制

此翻譯機(jī)制不依賴于mRNA 5′末端的帽狀結(jié)構(gòu)，但取決于mRNA是否含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site,IRES)。當(dāng)IRES存在時(shí)，40 S小亞基可直接與位于AUG密碼子上游的IRES結(jié)合，當(dāng)40 S小亞基向下游移動(dòng)、遇到合適的AUG時(shí)，即可啟動(dòng)蛋白翻譯[8]。這種翻譯模式多見多種病毒，例如，微小RNA病毒、古典型豬瘟病毒、牛病毒腹瀉病毒及丙型肝炎病毒等[2,9-10]。

1.5 核糖體分路翻譯機(jī)制

核糖體分路翻譯機(jī)制最早見于花椰菜花葉病毒[11]。這種翻譯模式不僅依賴于mRNA 5′末端帽狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)可通過非線性移動(dòng)的方式跨越低能量的發(fā)卡結(jié)構(gòu)或多個(gè)短小開放閱讀框架(short ORF,sORF)，直接抵達(dá)下游所需翻譯的ORF[3]。簡(jiǎn)單地說，核糖體首先與mRNA 5′區(qū)域中的供位結(jié)合，經(jīng)非線性遷移到達(dá)mRNA 3′區(qū)域內(nèi)的受位；然后沿著mRNA 向3′端繼續(xù)移動(dòng)，當(dāng)遇到適宜的AUG時(shí)，即可啟動(dòng)蛋白翻譯程序。此外，靠近mRNA 5′末端的sORF的長(zhǎng)度介于2個(gè)～10個(gè)密碼子時(shí)，通過核糖體分路翻譯機(jī)制合成蛋白的效率最佳[12]。

2 禽呼腸病毒的p10、p17 及σC蛋白的翻譯機(jī)制

在ARV的10個(gè)RNA基因節(jié)段中，其中有9個(gè)基因片段為單順反子，可以直接利用核糖體掃描翻譯機(jī)制合成相對(duì)應(yīng)的病毒蛋白產(chǎn)物。只有S1基因片段較為特殊，為多順反子結(jié)構(gòu)，含有3個(gè)相互重疊的ORFs，分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白σC及非結(jié)構(gòu)蛋白p10、p17。ARV S1基因中的3個(gè)ORF在先后排列次序上具有高度保守性 ，即ORF1(p10基因)接近S1基因的5′末端，ORF2(p17基因)位于S1基因中部，而ORF3(σC基因)則最靠近S1基因的3′末端[13]。

2.1 ARV S1基因的ORF1合成p10蛋白的機(jī)制

p10是ARV的非結(jié)構(gòu)蛋白，具有融合細(xì)胞的功能[14]。p10蛋白含有98個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量10 ku，由S1基因中的ORF1編碼[15]。ORF1的長(zhǎng)度為297個(gè)核苷酸，其翻譯起始密碼子AUG位于第25-27位核苷酸，而蛋白翻譯終止密碼子UGA則位于第319-321位核苷酸。

研究表明，Kozak M[16]序列(CCA-3CCAUGG+4)含有蛋白翻譯起始密碼子AUG所需的最佳堿基序列環(huán)境。人們將此序列里AUG中腺苷A的位置定為+1，并證明-3位的腺苷A或鳥苷G及+4位的鳥苷G可直接影響到蛋白翻譯起始的效率。p10基因的蛋白翻譯密碼子AUG周圍的堿基序列為U-3CGAUGC+4。由于此序列的-3位為尿嘧啶核苷U，不是堿基A或G；+4位的堿基為C而不是G，并非最佳的Kozak序列，所以認(rèn)為p10基因的AUG起始密碼子屬于蛋白翻譯的弱起動(dòng)子。若將此弱起動(dòng)子的堿基序列優(yōu)化接近于Kozak序列，即變成A-3CCAUGG+4后，則p10蛋白的表達(dá)量可以增加約15倍[17]。ORF1中第25-27位的AUG是S1 mRNA中的第1個(gè)起始密碼子，去除S1 mRNA 5′末端帽狀結(jié)構(gòu)會(huì)明顯抑制p10蛋白的表達(dá)[18]，因此普遍認(rèn)為ORF1是利用核糖體掃描翻譯機(jī)制來合成p10蛋白的。雖然p10蛋白的翻譯起始密碼子AUG最靠近S1 mRNA 5′末端，但由于它是蛋白翻譯的弱起動(dòng)子，因此在ARV感染細(xì)胞中，p10蛋白的表達(dá)量較低[18]。

2.2 ARV S1基因的ORF2合成p17蛋白的機(jī)制

p17是ARV的非結(jié)構(gòu)蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、激活p53和PTEN蛋白，促進(jìn)ARV在細(xì)胞內(nèi)的繁殖[19-20]。p17蛋白含有146個(gè)氨基酸，由S1基因中的ORF2編碼[15]。ORF2的長(zhǎng)度為441個(gè)核苷酸，其翻譯起始密碼子AUG位于第293-295位核苷酸，而蛋白翻譯終止密碼子UGA則位于第731-733位核苷酸[13]。此AUG周圍的堿基序列為A-3CAAUGC+4。雖然此序列中的-3位是腺苷A，但-4位卻不是鳥苷G，而是胞嘧啶核苷C。早期的研究認(rèn)為，+4位的鳥苷G是蛋白翻譯強(qiáng)起動(dòng)子的基本特征。后來研究發(fā)現(xiàn)+4位的鳥苷G并不像最初認(rèn)為的那么關(guān)鍵，只有當(dāng)-3位不是腺苷A時(shí)，位于+4位的鳥苷G才對(duì)蛋白翻譯的效率有明顯影響。目前認(rèn)為-3位的嘌呤堿基A或G，特別是腺苷A是蛋白翻譯強(qiáng)起動(dòng)子的重要特征[21]。所以，p17蛋白的翻譯起始密碼子AUG仍被看成是蛋白翻譯的強(qiáng)起動(dòng)子[17]。此外，將p10基因蛋白翻譯弱起動(dòng)子周圍的堿基優(yōu)化為強(qiáng)起動(dòng)子序列時(shí)，p10蛋白的表達(dá)增加，而p17蛋白的表達(dá)卻明顯減少[17]，提示S1 mRNA中的ORF2是利用漏過掃描機(jī)制來合成p17蛋白的。

2.3 ARV S1基因的ORF3合成σC蛋白的機(jī)制

σC是禽呼腸病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，氨基酸變異程度最高[22-23]。σC蛋白是ARV編碼的蛋白中唯一能吸附易感細(xì)胞的病毒蛋白，并能誘導(dǎo)被感染的細(xì)胞發(fā)生死亡[24]，同時(shí)σC蛋白是ARV的主要中和抗原，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抑制病毒繁殖的中和抗體[24]。σC蛋白含有326個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約為35 ku，由S1基因中的ORF3編碼[15]。ORF3長(zhǎng)度為978個(gè)核苷酸，在S1基因的3個(gè)ORF中長(zhǎng)度最長(zhǎng)[25]。σC蛋白翻譯起始密碼子AUG位于第630-632位核苷酸，而蛋白翻譯終止密碼子UAA位于第1 608-1 610位核苷酸[13]。σC蛋白的翻譯起始密碼子AUG周圍的堿基序列為G-3GGAUGG+4，第-3位和第+4位的堿基均為鳥苷G，屬于最佳的Kozak序列環(huán)境，所以此AUG被視為蛋白合成的強(qiáng)起動(dòng)子[13,16]。此外，這個(gè)AUG起動(dòng)子與S1基因的5′末端甲基化帽狀結(jié)構(gòu)之間的距離長(zhǎng)達(dá)600多個(gè)堿基。值得注意的是，σC蛋白的翻譯起始密碼子AUG(630-632 nt)的上游有4個(gè)AUG，前2個(gè)AUG屬于蛋白翻譯的弱起動(dòng)子(25-2 nt7,34-36 nt)，而后2個(gè) AUG則屬于強(qiáng)起動(dòng)子(293-295 nt,298-300 nt)[16]；其中1個(gè)弱起動(dòng)子(25-27 nt)負(fù)責(zé)編碼p10蛋白，而另外2個(gè)強(qiáng)起動(dòng)子負(fù)責(zé)分別編碼p17蛋白和σC蛋白[16]。那么，σC蛋白到底是通過什么翻譯機(jī)制來合成的呢？理論上有以下3種假設(shè)。

2.3.1 第1種假設(shè)：重新啟動(dòng)翻譯機(jī)制 考慮到編碼p10蛋白的ORF1 和編碼σC蛋白的ORF3之間不存在AUG起始密碼子[13]，一部分40S核糖體在完成p10蛋白的翻譯后，可能會(huì)繼續(xù)沿著S1 基因向3′末端移動(dòng)，當(dāng)遇到σC蛋白的翻譯起始密碼子AUG時(shí)，可重新啟動(dòng)蛋白翻譯。所以，重新啟動(dòng)翻譯是σC蛋白合成的可能機(jī)制之一。重新啟動(dòng)翻譯機(jī)制通常要求靠近5′末端、被首先翻譯的上游ORF(upstream ORF,uORF)的長(zhǎng)度少于30個(gè)密碼子[12]，而編碼p10蛋白的ORF1含有98個(gè)密碼子，至少3倍于30個(gè)密碼子的長(zhǎng)度。另外，將ORF1的蛋白翻譯弱起動(dòng)子AUG周圍的堿基序列優(yōu)化之后，不能顯著提高σC蛋白的表達(dá)量。因此，通過重新啟動(dòng)翻譯機(jī)制合成σC蛋白的可能性被排除[17-18]。

2.3.2 第2種假設(shè)：內(nèi)部啟動(dòng)翻譯模式 此模式認(rèn)為若一個(gè)mRNA含有IRES，則核糖體40S小亞基不需要與mRNA 5′末端的帽狀結(jié)構(gòu)相互作用，而能直接與mRNA內(nèi)部的IRES結(jié)合。當(dāng)40 S小亞基繼續(xù)沿著mRNA 的3′末端向前移動(dòng)、遇上合適的蛋白翻譯起動(dòng)子AUG時(shí)，就會(huì)與60 S核糖體大亞基結(jié)合，開始合成蛋白。由于S1基因mRNA 5′末端的非翻譯區(qū)很短，僅有24個(gè)核苷酸，形成RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性很小；同時(shí)在ORF1與ORF3之間的區(qū)域未發(fā)現(xiàn)莖-環(huán)樣的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此，通過內(nèi)部啟動(dòng)翻譯模式合成σC蛋白的假設(shè)也難以成立[18]。

2.3.3 第3種假設(shè)：促進(jìn)漏過掃描翻譯模式和非典型的核糖體分路翻譯機(jī)制 一些研究人員認(rèn)為，σC蛋白的合成與IRES結(jié)構(gòu)無關(guān)，但依賴于蛋白翻譯起始因子eIF4G的功能以及S1 mRNA 5′末端的帽狀結(jié)構(gòu)，并能以非線性移動(dòng)的方式到達(dá)σC蛋白翻譯起始密碼子的上游區(qū)域[18]，通過促進(jìn)漏過掃描機(jī)制合成σC蛋白。另一些試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，σC蛋白是以全長(zhǎng)的S1 mRNA為模板而合成的，并且σC蛋白翻譯的效率基本上不受uORF的影響。

Racine T等[18]早期提出的假設(shè)認(rèn)為，核糖體與S1 mRNA的5′末端帽狀結(jié)構(gòu)結(jié)合，翻譯p10蛋白后，可以通過非線性的移動(dòng)方式到達(dá)σC蛋白的翻譯起始密碼子附近的區(qū)域，啟動(dòng)σC蛋白的合成。隨后的研究顯示，核糖體能通過兩種不同的、依賴于S1 mRNA 5′末端帽狀結(jié)構(gòu)的模式接近σC蛋白的翻譯起始密碼子[19]。模式一為促進(jìn)漏過掃描翻譯模式。在此模式中，核糖體能有效通過多個(gè)uORF中處于較佳堿基序列環(huán)境的AUGs，靠近σC蛋白的翻譯起始密碼子。模式二為非典型的核糖體分路翻譯機(jī)制。此模型不依賴于漏過掃描翻譯機(jī)制，相對(duì)不受uORF的影響，但仍依賴于S1 mRNA 5′末端的帽狀結(jié)構(gòu)，并需要借助于ORF2中蛋白翻譯增強(qiáng)子(translation enhancer element,TEE)的幫助，將40 S小亞基轉(zhuǎn)送到σC蛋白翻譯起始密碼子上游的區(qū)域[19]。具體來說，與S1 mRNA 5′末端帽狀結(jié)構(gòu)相結(jié)合的40 S小亞基，可繞過1個(gè)或幾個(gè)uORFs中的AUGs，被直接轉(zhuǎn)移到p17蛋白的翻譯起始密碼子下游的區(qū)域。這種轉(zhuǎn)移過程與ORF2中所含的蛋白翻譯增強(qiáng)子TEE有關(guān)。TEE由27個(gè)核苷酸組成，位于S1 mRNA中的第366位和392位核苷酸之間。其中的6個(gè)核苷酸(CCCAUC)含有與18 S rRNA互補(bǔ)的堿基序列，能促進(jìn)40S小亞基以非線性方式轉(zhuǎn)移到σC蛋白翻譯起始密碼子上游區(qū)域。因此，目前一般認(rèn)為，σC蛋白是通過促進(jìn)漏過掃描翻譯模式和非典型的核糖體分路翻譯兩種機(jī)制進(jìn)行合成的[19]。

3 結(jié)語

禽呼腸病毒S1 mRNA自身結(jié)構(gòu)中含有能發(fā)揮順式作用的蛋白翻譯增強(qiáng)子TEE，可以通過促進(jìn)漏過掃描翻譯和非典型的核糖體分路兩種翻譯機(jī)制，幫助核糖體接近σC蛋白的翻譯起始密碼子[19]，以便產(chǎn)生適量的σC蛋白。由于ARV的 σC蛋白直接參與病毒吸附易感細(xì)胞的早期階段，因此保證σC蛋白的適量表達(dá)對(duì)ARV進(jìn)入易感細(xì)胞和產(chǎn)生新的子代病毒尤為重要。深入研究涉及S1基因多順反子合成病毒蛋白的影響因素，有助于進(jìn)一步闡明禽呼腸病毒p10、p17和σC蛋白翻譯的確切機(jī)制，幫助發(fā)現(xiàn)調(diào)控這3種病毒蛋白表達(dá)的相關(guān)因子，找出抑制ARV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制繁殖的關(guān)鍵靶位，對(duì)研發(fā)抗ARV新藥及ARV疫苗具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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