陳小琴,趙一霏,孫 巖,馮曉慧,曹 輝,魏 澍，姚龍泉，張 飛，沈國順，劉金玲*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110161；2.遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心,遼寧沈陽 110164)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又稱豬藍耳病，該病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起豬的一種高度接觸性傳染病，是威脅當今養(yǎng)豬業(yè)最重要的疫病之一，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。該病以造成母豬晚期生殖衰竭、仔豬呼吸窘迫、免疫抑制和持續(xù)性感染等為主要臨床癥狀[2]。從2006年起，我國南方部分省市陸續(xù)暴發(fā)了高致病性豬藍耳病，哺乳仔豬發(fā)病率達100%，保育仔豬發(fā)病率為70%，育肥豬發(fā)病率為20%[3]。懷孕各階段的母豬也會受到影響，妊娠母豬流產(chǎn)率高達40%以上，母豬病死率可達10%。PRRSV感染后，PRRSV在體內(nèi)主要感染豬肺泡巨噬細胞，也可以感染淋巴結(jié)、扁桃體、胸腺、巨噬細胞和脾等免疫器官，引起免疫抑制[4]。目前PRRSV在我國依然存在，并對我國豬群造成的巨大危害依然存在，但其致病機制還未完全闡明。近期相關(guān)研究表明，自噬與病毒感染具有相關(guān)性，自噬對不同病毒產(chǎn)生積極或是消極的影響。因此，本文對PRRSV及自噬的相關(guān)性進行綜述，為闡明PRRSV的致病機制提供參考。

1 PRRSV概述

1.1 PRRSV病原

PRRSV屬于一種動脈炎病毒，單股正鏈RNA，病毒粒子直徑為50 nm～65 nm，呈卵圓形，有囊膜，且囊膜上，含糖蛋白GP5、GP2a、GP3、GP4、非糖基化M蛋白和2b蛋白，這些蛋白與細胞受體在病毒復(fù)制中起著重要的作用[5]。其中病毒糖基化囊膜蛋白(GP5)是該病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，它主要參與病毒入侵宿主細胞的過程，并誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和性抗體。此外，糖基化囊膜蛋白GP5還具有誘導(dǎo)細胞凋亡、參與病毒粒子與病毒受體結(jié)合的過程等[6]。

1.2 PRRSV的基因型

PRRSV根據(jù)基因型將病毒分為美洲型(基因型1型),即VR-2332；歐洲型(基因型2型),即LV型，它們的核苷酸同源性為60%。目前，在我國以美洲型為，主根據(jù)其致病性可分為經(jīng)典PRRSV(C-PRRSV)和高致病性PRRSV(HP-PRRSV)毒株[7]。最近報道出現(xiàn)4種新型高致病性PRRS病毒(HP-PRRSV)毒株，分別被命名為14LY01-FJ、14LY02-FJ、15LY01-FJ和15LY02-FJ，仔豬和母豬感染后發(fā)病率為100%，病死率達40%～80%[8]。不同的毒株對細胞的適應(yīng)性不同，在體內(nèi)，PRRSV的所有毒株對肺泡巨噬細胞的適應(yīng)性最高；在體外，LV僅能適應(yīng)于巨噬細胞，VR-2332除了能在巨噬細胞上很好增殖外，還可在Marc-145、MA-104細胞系培養(yǎng)，無論那一種毒株都具有免疫抑制特性，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失。

1.3 PRRSV的致病機制

PRRSV是通過呼吸道或生殖道感染豬肺泡巨噬細胞和單核細胞,并在巨噬細胞和單核細胞中增殖分化。當PRRSV進入細胞后，它的病毒囊膜不會直接與細胞膜融合，而是通過細胞上的相關(guān)受體結(jié)合，經(jīng)受體調(diào)節(jié)內(nèi)吞進入宿主細胞[9]。目前，已發(fā)現(xiàn)的相關(guān)受體有CD163、硫酸乙酰肝素、唾液酸黏附素、波形蛋白、DC-SIGN、CD151，其中CD163是PRRSV最主要的核心受體，且決定了細胞對病毒的敏感性。唾液酸黏附素主要與病毒上的GP5和M的異源二聚體復(fù)合物結(jié)合，介導(dǎo)PRRSV胞吞到肺泡巨噬細胞中，因此被視為一個潛在PRRSV的中介。硫酸乙酰肝素在識別PRRSV后，建立一個早期PRRSV的附體和促進PRRSV跟唾液酸黏附素的相互作用。波形蛋白在Marc-145細胞表面與PRRSV的N蛋白相結(jié)合并通過在BHK-21轉(zhuǎn)染表達，表明能夠增強PRRSV反式傳遞到靶細胞的能力。CD151屬于跨膜蛋白，呈現(xiàn)出多樣的細胞功能，包括細胞信號、細胞活化和血小板聚集等，可促進PRRSV的感染，具體作用尚不清楚?？傊?，這些受體參與PRRSV結(jié)合宿主細胞啟動PRRSV的感染[10-11]。隨后，PRRSV進入肺泡巨噬細胞并在肺泡巨噬細胞中破裂、溶解、崩解，導(dǎo)致肺泡巨噬細胞功能下降或喪失，從而使豬體患病。

2 細胞自噬

2.1 細胞自噬的分類及誘導(dǎo)發(fā)生過程

細胞自噬(autophagy)是維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種生理現(xiàn)象，是用來降解蛋白及大分子物質(zhì)和回收受損細胞器的過程[12]。它可以分為宏自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)自噬，一般所說的自噬是宏自噬。自噬的發(fā)生過程需要5個階段，即誘導(dǎo)、成核、形成自噬小泡、自噬小泡與溶酶體融合和底物降解[13]。在自噬誘導(dǎo)期，細胞環(huán)境受營養(yǎng)物質(zhì)或病原體的刺激，誘導(dǎo)細胞質(zhì)內(nèi)形成游離的雙層膜結(jié)構(gòu)，隨后慢慢凹陷形成自噬前體(proautophagosome,PAS)，接著PAS結(jié)構(gòu)樣膜持續(xù)延伸，包裹住大分子物質(zhì)和受損的細胞器等，從而形成自噬體。然后，自噬體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體。隨后，自噬體內(nèi)膜被溶酶體酶降解，同時大分子物質(zhì)及蛋白質(zhì)也被降解后釋放出一些能量參與物質(zhì)的活動[14]?？傊?，細胞自噬實現(xiàn)了細胞本身代謝的需要和某些細胞器的更新，它在細胞生長、發(fā)育和疾病發(fā)生中起著關(guān)鍵的作用[15]。

2.2 自噬常見的分子標志物

在生理狀態(tài)下，細胞自噬形成過程相當復(fù)雜，它需要一系列的自噬分子維持自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能的正常。在此期間，會出現(xiàn)自噬標志物，研究中使用最廣泛的分子標志物是LC3(微管相關(guān)蛋白1輕鏈3)，它包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種轉(zhuǎn)化形式，LC3主要參與自噬體膜的形成。在檢測細胞自噬中，通過比較組間LC3-Ⅱ的表達水平來測定細胞自噬，也可通過計算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值來測定，總之，LC3-Ⅱ是自噬檢測的常見標記物[16]。

常用的自噬標志物除了LC3外，還有Beclin-1、p62等。Beclin-1基因最早在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn),其調(diào)控編碼的蛋白與B細胞淋巴瘤/白血病2基因(bcl-2)相互作用，在病毒的復(fù)制中起作用[17]。有研究表明，Beclin-1在心臟中起一定作用，可作為影響心臟細胞自噬的自噬標志物[18]。p62定位于細胞核，在細胞質(zhì)中合成。自噬發(fā)生時，常與LC3-Ⅱ形成復(fù)合物，因此，p62是反映自噬活性的標記蛋白?？傊允蓸擞浳镌诩毎麢z測中發(fā)揮重要的作用。

2.3 自噬與微生物病原體

自噬是一把雙刃劍，可清除病原體的感染，也可為病原體的復(fù)制和發(fā)育提供有利的條件。

細菌是微生物中的一員，它會產(chǎn)生各種毒力因子與宿主相互作用而致病。沙門菌屬是存在腸道中的革蘭陰性菌，引起人畜腸炎、傷寒和敗血癥等。當沙門菌進入宿主機體后，宿主為了維持細胞穩(wěn)態(tài)平衡，將產(chǎn)生自噬現(xiàn)象。而沙門菌為防止宿主免疫清除不斷進化，細胞出現(xiàn)異源自噬。所謂異源自噬就是機體通過自噬途徑清除和限制病原體在胞內(nèi)的繁殖。有研究表明，沙門菌中還有一個保守基因，沙門菌質(zhì)粒毒力基因(spv)，能影響哺乳動物細胞自噬水平，增強宿主菌的毒力，促進細菌在體內(nèi)的繁殖，而對傷寒沙門菌所致的異源自噬具有抑制作用[19-20]。多種細菌(無形體、李斯特菌、鏈球菌等)可通過自噬途徑被清除，同時可利用自噬繁殖。病毒是一種胞內(nèi)寄生微生物，它的復(fù)制與培養(yǎng)取決于細胞機制的調(diào)控。豬瘟病毒是單股正鏈RNA病毒，當機體感染豬瘟病毒后，會誘導(dǎo)自噬穩(wěn)態(tài)的產(chǎn)生并通過對自噬的調(diào)控，促進豬瘟病毒在體內(nèi)的復(fù)制。有研究已證明，自噬體結(jié)構(gòu)有利于豬瘟病毒的復(fù)制[21]。藍舌病是一種重要蟲媒傳染病，藍舌病病毒感染明顯促進了自噬底物的降解，觸發(fā)完整的自噬潮反應(yīng)。由于自噬囊泡的酸化，為病毒復(fù)制提供一個有利的環(huán)境，從而促進藍舌病病毒的復(fù)制[22]。白斑綜合征病毒、日本腦炎病毒、豬圓環(huán)病毒等都可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生自噬，細胞機制調(diào)控自噬促進病毒的復(fù)制。

3 自噬與PRRSV的相互作用

3.1 PRRSV感染誘導(dǎo)自噬體的形成

研究發(fā)現(xiàn)，自噬在病毒感染中發(fā)揮一定作用，一些病毒可以誘導(dǎo)自噬的形成。祁保民等在雞馬立克病研究中發(fā)現(xiàn)了自噬體的形成。宋超輝在電鏡下觀察到皰疹病毒感染SH-SY5Y細胞，發(fā)現(xiàn)空泡及自噬化現(xiàn)象。這些發(fā)現(xiàn)使病毒性疾病的致病機制的研究有了進一步的突破，自噬與病毒的相互作用成為各個領(lǐng)域研究的對象。自噬與PRRSV的相互作用也于2013年被證實，PRRSV的NSP5、NSP6和NSP7蛋白和它的受體(包括硫酸乙酰肝素、波形蛋白、CD151、唾液酸黏附素、DC-SIGN和CD163)結(jié)合，并誘導(dǎo)細胞自噬體的形成[23]。當PRRSV感染細胞時會改變細胞穩(wěn)態(tài)，為了維持細胞穩(wěn)態(tài)的代謝過程，細胞內(nèi)出現(xiàn)一系列的自噬變化。孫明霞等[24]用PRRSV的VR-2332株感染Marc-145細胞，并運用透射電鏡、激光共聚焦、免疫熒光、Western blot等方法，檢測Marc-145細胞內(nèi)自噬分子標記物，結(jié)果表明，PRRSV感染可以誘導(dǎo)Marc-145細胞產(chǎn)生自噬現(xiàn)象，而且發(fā)現(xiàn)病毒的復(fù)制過程是誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生所必須的。

3.2 自噬促進PRRSV的復(fù)制

自噬作為細胞的生存機制之一，在病原微生物感染過程中起到重要的調(diào)控作用。當病毒感染時，細胞可以通過自噬清除病毒，而病毒可以利用自噬促進自身的復(fù)制，如冠狀病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、呼吸道合胞病毒等在感染細胞后利用自噬系統(tǒng)完成細胞的自噬。Chen Q等[25]用PRRSV毒株WUH3感染Marc-145細胞，以雷帕霉素處理感染的Marc-145細胞，結(jié)果顯示用雷帕霉素處理的細胞病毒的滴度顯著升高。為了進一步確定自噬體在PRRSV感染期間是否調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制，他再次利用自噬特異性抑制劑(3-MA)處理細胞，在不同時間點觀察，PRRSV滴度下降，進一步說明自噬可以促進PRRSV的復(fù)制。Pujhari S等[26]也通過雷帕霉素處理感染的細胞。也有研究者用敲除Beclin-1基因的方法驗證自噬與PRRSV感染的相互作用，結(jié)果表明，敲除Beclin-1基因降低PRRSV的產(chǎn)率。以上研究表明，自噬增強PRRSV的復(fù)制。

3.3 PRRSV感染抑制自噬體與溶酶體的融合

自噬形成過程中需要自噬體與溶酶體的融合來降解一些大分子物質(zhì)。當一些外來病原進入機體后誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生自噬，在自噬產(chǎn)生后會出現(xiàn)短期的自噬體樣結(jié)構(gòu)。有研究者認為，這種現(xiàn)象的原因可能是自噬體與溶酶體結(jié)合受阻造成的。孫明霞等用PRRSV感染含有標記自噬體的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-LC3的Marc-145細胞和染色標記溶酶體，用激光共聚焦共定位觀察，在PRRSV感染的Marc-145細胞內(nèi)，GFP-LC3點狀分布顯著增加，且溶酶體與自噬體有很少共定位；而在沒有感染PRRSV的Marc-145細胞內(nèi)，GFP-LC3點狀分布少，而溶酶體與自噬體共定位比較多。為了排除其他條件的影響，又用溶酶體特異性標志分子(LAMPl)進行了共定位分析，在未感染PRRSV細胞，其PCC值為0.188；而在PRRSV感染的細胞內(nèi)，其PCC值僅為-0.017 4，說明PRRSV感染抑制自噬體與溶酶體的融合[24]。

3.4 PRRSV感染促進自噬體的降解

自噬在PRRSV感染階段發(fā)生不同的變化，在自噬體形成期，PRRSV感染會誘導(dǎo)自噬體的形成，而在降解期，PRRSV感染會促進自噬體的降解嗎？已有其他的相關(guān)研究表明，其他病毒如脊髓灰質(zhì)炎病毒、小鼠肝炎病毒等會促進自噬體的降解，為了證明PRRSV也同其他病毒一樣促進自噬體的降解，Chen Q等[25]做了Lyso-Tracker和LC3的共定位分析、LC3-Ⅱ的周轉(zhuǎn)分析和p62的降解分析試驗，證明PRRSV感染Marc-145細胞后誘導(dǎo)了自噬體的形成，并促進了自噬體的降解。

4 小結(jié)

病毒與細胞的相互作用是一個極其復(fù)雜的過程，目前，自噬在人體疾病中的研究十分流行，而在豬病方面的研究還不太多，不論在何種動物體內(nèi)，自噬并不是一個單獨的體系，它的發(fā)生總會伴隨著細胞的各種變化與效應(yīng)。自噬在一些病原物的誘導(dǎo)下，自噬的一些關(guān)鍵因子LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62、mTOR等發(fā)生變化，根據(jù)這些關(guān)鍵因子的變化，判斷自噬發(fā)生水平。盡管自噬的研究已取得了進展，但針對于臨床還是有一些難度，還需要大量的研究與實踐，尤其在一些易變的RNA病毒中。已有大量的研究表明細胞自噬在機體免疫機制中起著一定作用，可作為細胞屏障防止細胞感染，但同時為病原體提供感染條件。即使這些研究已經(jīng)為預(yù)防疾病提供了一些方便，但還沒有完全弄清自噬是通過什么通路或蛋白控制病原體的感染。因此，還需做更進一步的研究，為控制疾病提供更準確的目標。