楊永恒， 徐曉洋， 孫玉明， 原海燕， 劉清泉， 張永俠， 王銀杰， 黃蘇珍， 佟海英

(江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇南京 210014)

甜菊(SteviarebaudianaBertoni)又稱甜葉菊，是菊科(Asteraceae)甜菊屬(Stevia)多年生草本植物，原產于南美洲巴拉圭等地。甜菊因其葉片可提取高甜度低熱量的甜菊糖苷而從20世紀70年代開始受到人們的廣泛關注[1]。甜菊葉片所含甜菊糖苷有多達30種組分，各組分的結構相似，性質迥異。甜菊苷(stevioside，St)和萊鮑迪苷A(rebaudioside A，R-A)是兩大主要組分，占總糖苷含量的60%～80%。St苷的甜度為蔗糖的250～300倍，略帶苦味，具有藥用價值，R-A 苷的甜度為蔗糖的350～450倍，且具有更接近蔗糖的甜味[2]，因此在甜菊種質創(chuàng)新研究中，為滿足不同應用目的的需要，提高St苷、R-A苷等單一糖苷的生物積累及其在總苷中的比例成為甜菊育種學家競相研究的熱點。

在甜菊糖苷生物合成途徑中，葡萄糖苷轉移酶SrUGT76G1專一地對St苷的C-13位C-3′進行糖基化，將其轉化為R-A苷[3]，所以SrUGT76G1是St苷和R-A苷合成的關鍵基因。研究該基因的表達調控對了解R-A苷的生物合成和今后通過基因工程等手段人為調控R-A苷的合成具有重要意義，但是目前對SrUGT76G1的表達調控模式還不清楚。啟動子作為基因表達調控的重要區(qū)域，研究SrUGT76G1啟動子對于了解這一關鍵基因的表達調控具有重要意義，但在甜菊研究中目前尚無相關報道。

本試驗在SrUGT76G1基因研究的基礎上，根據已克隆到的SrUGT76G1基因DNA序列設計嵌套引物，擴增基因上游未知序列，通過啟動子序列分析初步探究序列上的功能元件。為了更深入地研究該基因的表達調控，進一步構建植物表達載體，用1 989 bp的SrUGT76G1啟動子取代pCAMBIA1301-220中的CaMV35S組成型啟動子，連接GUS報告基因，構建pCAMBIA1301-220-SrUGT76G1P載體，通過農桿菌介導的基因瞬時表達的方法初步驗證SrUGT76G1啟動子的活性，為今后深入研究SrUGT76G1基因的表達調控和甜菊分子育種奠定基礎。

1　材料與方法

1.1　材料

試驗于2014年7月至2015年6月在江蘇省中國科學院植物研究所進行。用于DNA提取的甜菊葉片取自本實驗室甜菊種質資源圃。植物表達載體pCAMBIA1301-220由南京農業(yè)大學園藝學院菊花實驗室惠贈；根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105、大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株TOP10、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA Marker、測序載體pMD19-T Vector、TaqDNA polymerase、各種限制性核酸內切酶與試劑購自TaKaRa公司；氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、IPTG、X-gal、Real Master Mix SYBR GreenⅠ、質粒提取試劑盒購自北京天根生化科技公司；GUS活性檢測試劑購自Sigma公司；其他常用化學試劑為國產分析純。

1.2　方法

1.2.1SrUGT76G1啟動子的克隆采用改良CTAB法提取甜菊基因組DNA。以提取的甜菊基因組DNA為模板，根據已知的SrUGT76G1序列設計3個嵌套的特異性引物SP1、SP2、SP3。hiTAIL-PCR反應程序參照Liu等的方法[4]進行。第1輪PCR用特異性引物SP1與簡并引物LAD1-1、LAD1-2、LAD1-3、LAD1-4組合，建立4個平行的25 μL PCR反應體系進行擴增；第2輪PCR將第1輪的PCR產物稀釋50倍，取1 μL作為反應模板，用簡并引物AC1與特異性引物SP2擴增；第3輪PCR將第2輪的PCR產物稀釋50倍，取1 μL作為反應模板，用簡并引物AC1與特異性引物SP3擴增，經過3輪PCR擴增得到SrUGT76G1的上游序列。根據第一次步移得到的序列設計特異性引物SP4、SP5、SP6，以相同方法進行第二次步移，將2次步移得到的序列拼接，并設計全長引物pro-1F、pro-1R，最終得到SrUGT76G1的啟動子序列。試驗所用引物序列及反應程序詳見表1、表2。

表1　甜菊SrUGT76G11啟動子步移及分析引物

表2　hiTAIL-PCR反應程序

1.2.2SrUGT76G1啟動子作用元件分析將甜菊SrUGT76G1啟動子序列提交PLACE服務器(http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)，預測該啟動子保守區(qū)域中潛在的順式作用元件。

1.2.3植物表達載體構建植物表達載體pCAMBIA1301-220是含有CaMV35S啟動子和GUS基因系統(tǒng)的雙元載體。為了研究SrUGT76G1啟動子的功能，本研究中用SrUGT76G1啟動子取代pCAMBIA1301-220中的CaMV35S組成型啟動子，連接GUS報告基因，構建植物表達載體pCAMBIA1301-220-SrUGT76G1P。將引物pro-2F和pro-2R(引物序列見表1，劃橫線處分別為限制性內切酶SacⅠ和NcoⅠ的酶切位點)擴增得到的含酶切位點的SrUGT76G1啟動子片段連接到pMD19-T(2 692 bp)載體上，得到重組質粒pMD19-T-SrUGT76G1P。將重組質粒pMD19-T-SrUGT76G1P和質粒pCAMBIA1301-220分別用限制性內切酶SacⅠ和NcoⅠ進行雙酶切，酶切產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，分別切膠回收pMD19-T-SrUGT76G1P小片段和pCAMBIA1301-220大片段，用T4 DNA連接酶連接2個目的片段，連接產物轉化至大腸桿菌TOP10菌株感受態(tài)細胞中。將經藍白斑篩選、PCR檢驗和SacⅠ、NcoⅠ雙酶切鑒定都正確的重組質粒命名為pCAMBIA1301-220-SrUGT76G1P。

1.2.4SrUGT76G1啟動子功能的瞬時表達分析將重組質粒pCAMBIA1301-220-SrUGT76G1P和質粒 pCAMBIA1301-220 分別轉化至農桿菌EHA105中[5]。已轉化的農桿菌在5 mL含利福平和卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基中28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，取2 mL菌液轉入10 mL含同樣抗生素的新鮮培養(yǎng)液中，28 ℃振蕩培養(yǎng)36～48 h，離心培養(yǎng)物并用5 mL MMA{1×MS，10 mmol/L MES[2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid]，200 μmol/L乙酰丁香酮，pH值5.6}重懸菌體，28 ℃保溫3 h，5 000 min離心10 min，沉淀用2 mL 10 mmol/L 的MgCl2洗滌1次，菌體用2 mL 10 mmol/L的MgCl2懸起。取14 d左右的甜菊和擬南芥無菌幼苗分別浸沒在含重組質粒pCAMBIA1301-220-SrUGT76G1P和質粒pCAMBIA1301-220的上述農桿菌菌液中，以10 mmol/L MgCl2溶液為空白對照，真空(10 Pa)處理30 min，然后用無菌水將幼苗沖洗3次，放置在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，24℃、12 h/d光照培養(yǎng)。分別于2、4、6 d后取樣進行GUS染色。GUS染色液的配制按照Jefferson等的方法[6]進行，將待測材料和對照材料放入1.5 mL的離心管中，加入GUS染色液，37 ℃保溫24 h，將染色后的材料用70%、80%、90%、100%乙醇依次脫色，至空白對照為白色時用體視顯微鏡觀察并拍照。

2　結果與分析

2.1　SrUGT76G1啟動子序列的獲得

根據已知SrUGT76G1基因序列設計步移引物，采用Liu等的未知側翼序列擴增的方法[4]，第一次步移克隆到了 1 107 bp 的片段，經測序和NCBI blast比對，結果表明所得序列的3′端與數據庫中SrUGT76G1基因5′序列完全重疊，得到了ATG前862 bp的序列。根據克隆到的序列再設計3個嵌套引物繼續(xù)向5′端步移，得到1 580 bp片段，亞克隆后測序，比對結果顯示其3′端與第一次步移所得序列的5′端重疊。將2次步移得到的序列進行拼接，并重新設計1對序列特異引物從甜菊基因組DNA中克隆完整的SrUGT76G1啟動子區(qū)域，將擴增到的序列進行NCBI blast，結果表明該序列3′端與數據庫中SrUGT76G1基因序列5′端同源，最終得到SrUGT76G1基因ATG前2 283 bp的啟動子序列(圖1)。

2.2　啟動子順式作用元件預測和序列分析

將克隆得到的啟動子全長序列提交PLACE，進行順式調控元件的分析，啟動子序列正反向包含475個調控元件(表3)，含有典型的啟動子保守元件，有21個TATA box；如：TATABOX2、TATABOX3、TATABOX4、TATABOX5和TATAPVTRNALEU；36個CAATBOX1和9個CCAATBOX1，它們是CAAT box的基序；2個ACGTTBOX，ACGTTBOX是1個ACGT元件；有2個AMYBOX1，它是5′上游區(qū)域的保守序列；19個MYB結合位點的同源序列，如：MYB1AT、MYB2AT、MYB2CONSENSUSAT、MYBATRD22、MYBCORE、MYBCORE ATCYCB1和MYBST1等。有12個MYCCONSENSUSAT的同源序列，1個MYCATERD1和1個MYCATRD22，它們是MYC結合位點；發(fā)現(xiàn)有植物多腺苷酸化信號的保守序列，8個POLASIG1，3個POLASIG2和6個POLASIG3[7]。

除了以上所述的保守元件，該啟動子序列還含有多個植物激素相關的順式調控元件，1個SURECOREATSULTR11，它是硫和生長素的響應元件[8]；ARFAT是ARF(植物生長素響應因子，auxin response factor)的結合位點；2個ASF1MOTIFCAMV同源序列，它是植物生長素和/或水楊酸響應元件，并參與光調控；3個WBOXATNPR1的同源序列，參與水楊酸(SA)信號轉導；3個DPBFCOREDCDC3，是bZIP轉錄因子結合位點和受ABA誘導的[9]；含有CPBCSPOR同源序列，是細胞分裂素增強蛋白(cytokinin-enhanced protein)結合的關鍵序列，最早在黃瓜POR(NADPH-protochlorophyllide reductase)基因啟動子序列中被發(fā)現(xiàn)[10]；以及乙烯響應元件ERELEE4、GCCCORE、LECPLEACS2和赤霉素響應元件GARE1OSREP1、GAREAT、PYRIMIDINEBOXHVEPB1、PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A等。

該啟動子序列還含有多個環(huán)境因子響應的順式調控元件：有2個CBFHV同源序列，分別為ABRELATERD1和DRECRTCOREAT，它們是脫水響應元件；6個ACGTATERD1的同源序列，是erd1(early responsive to dehydration)基因[11]黃化誘導表達必需的。LTRECOREATCOR15是在擬南芥cor15a基因啟動子中發(fā)現(xiàn)的低溫響應元件LTRE的核心基序[12]。還有厭氧響應元件ANAERO1CONSENSUS，以及一些光調控元件，如：GT1CONSENSUS、IBOXCORE、INRNTPSADB、REALPHALGLHCB21、SORLIP1AT和SORLIP2AT等。其中GT1CONSENSUS是許多光調控基因保守的GT-1結合位點[13-14]。順式調控元件10PEHVPSBD、CIACADIANLELHC和EVENINGAT參與生理節(jié)律調控[15-17]。

此外，還發(fā)現(xiàn)SrUGT76G1啟動子序列含有一些組織特異性表達元件：有22個GATABOX的同源序列，它們參與光調控和組織特異性表達[18]；ACGTOSGLUB1元件參與胚乳特異性表達；DPBFCOREDCDC3參與胚特異性表達；NTBBF1ARROLB參與組織特異性表達和植物生長素誘導[19]；OSE1ROOTNODULE和OSE2ROOTNODULE為器官特異性表達元件，在根瘤感染細胞中被激活；POLLEN1LELAT52是2個相互依賴的花粉特異性表達的元件之一；RYREPEATBNNAPA是種子特異性表達元件；TAAAGSTKST1是保衛(wèi)細胞特異表達調控元件。

表3　SrUGT76G1啟動子序列上部分順式調控元件

2.3　含雙酶切位點SrUGT76G1基因啟動子片段的獲得

以含酶切位點的引物pro-2F和pro-2R克隆得到甜菊SrUGT76G1基因的啟動子序列，其長度為1 989 bp，提交至NCBI GenBank，獲得登錄號為KM206772。序列分析結果見圖2，除了TATA box等保守元件外，還有MYB、MYC識別位點，病原體和鹽響應元件GT1GMSCAM4，鈣響應元件ABRERATCAL，水楊酸響應元件WBOXATNPR1，糖響應元件WBOXHVISO1，赤霉素響應元件GAREAT和增強子CTRMCAMV35S等。

2.4　SrUGT76G1基因啟動子植物表達載體的構建

植物表達載體pCAMBIA1301-220是含有CaMV35S啟動子和GUS基因系統(tǒng)的雙元載體。為了驗證所克隆的SrUGT76G1啟動子序列是否具有活性，設計引物引入SacⅠ和NcoⅠ酶切位點，用SrUGT76G1啟動子取代 pCAMBIA1301-220 中的CaMV35S組成型啟動子，連接GUS報告基因，構建植物表達載體pCAMBIA1301-220-SrUGT76G1P(圖3)。根據啟動子全長序列設計質粒構建引物pro-2F(5′端帶SacⅠ酶切位點)和pro-2R(3′端帶NcoⅠ酶切位點)，NcoⅠ酶切位點中的ATG是SrUGT76G1基因的起始密碼子，同時也是載體上GUS基因起始密碼子。

2.5　基因瞬時表達分析

采用農桿菌滲透法分別轉化擬南芥和甜菊幼苗，被侵染的甜菊和擬南芥幼苗分別在不同的處理時間取出(1 d、2 d、3 d 和4 d)進行GUS染色，結果用含質粒pCAMBIA1301-220和pCAMBIA1301-220-SrUGT76G1P的農桿菌侵染的幼苗都表現(xiàn)出GUS基因的有效表達(圖4)，說明所克隆到的SrUGT76G1基因啟動子具有啟動活性，可以用于下一步的研究。同時試驗中發(fā)現(xiàn)，被侵染的甜菊幼苗在第3天GUS的表達到高峰，隨后組織褐化；而在擬南芥中24 h后逐漸增強并在第3、第4天持續(xù)表達。

3　討論與結論

基因的表達調控是基因功能的基本部分，基因啟動子上關鍵元件是其表達調控的概況[20-21]。了解植物啟動子非常有意義，并且在很多方面為通過生物技術控制基因表達提供可能[22-23]。盡管如此，目前甜菊基因啟動子研究的報道還很少，僅有關于SrHDR基因啟動子的研究[24]。甜菊SrUGT76G1基因是RA苷合成的關鍵基因[25-26]，研究SrUGT76G1基因的表達調控對于了解植物體內甜菊糖苷積累的規(guī)律和今后通過生物技術手段進行甜菊育種都有重要的意義，但是目前尚無相關報道。本試驗在研究SrUGT76G1基因的基礎上，通過染色體步移的方法克隆了該基因的5′端側翼序列，采用在線的啟動子分析工具預測該SrUGT76G1啟動子序列上的調控元件，結果顯示雙向序列包含475個調控元件，除了典型的啟動子元件，如：TATA-box、CAAT-box、MYB結合位點等外，還有生長素、赤霉素、細胞分裂素、乙烯、ABA、水楊酸和茉莉酮酸酯等植物激素響應元件，和光、脫水、低溫、厭氧等環(huán)境因子響應元件，以及芽、胚乳等組織特異性表達元件，可見SrUGT76G1表達調控的復雜性。

因為獲得穩(wěn)定的轉基因植株耗時費力，為了快速驗證克隆的啟動子片段是否有活性，我們采用了農桿菌真空滲透的瞬時轉化法[27]。結果表明SrUGT76G1啟動子可以驅動GUS報告基因的表達，證明克隆到的5′側翼序列具有啟動子活性。啟動子克隆、序列分析和啟動子活性初步驗證只是SrUGT76G1基因表達調控研究的開始，這些順式元件的功能和對SrUGT76G1基因表達的調控作用等還有待深入研究，如進一步構建一系列5′端缺失啟動子的表達載體，通過對擬南芥及甜菊中的遺傳轉化獲得穩(wěn)定的轉基因植株，進而研究各順式調控元件的功能及調控因子等。

甜菊糖苷的生物合成與赤霉素有著密切的關系，它們共用生物合成途徑的起始階段，直至共同的前體物質貝殼杉烯酸的合成[28]。因此我們曾推測SrUGT76G1的表達受赤霉素調控，正如我們所期望的，啟動子順式調控元件預測的結果表明該序列上有7個赤霉素響應元件，包括2個GARE1OSREP1、1個GAREAT、1個PYRIMIDINEBOXHVEPB 1和3個PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A。GARE1OSREP1(TA ACAGA)是在水稻一個半胱氨酸蛋白酶(REP-1)基因啟動子上發(fā)現(xiàn)的，該基因的表達受赤霉素的誘導[29]。GAREAT則是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的赤霉素響應元件[30]；PYRIMIDINEBOXHVEPB1是一個嘧啶盒(Pyrimidine box)，在大麥EPB-1(半胱氨酸蛋白酶)基因啟動子上發(fā)現(xiàn)，并且確定為赤霉素誘導必需的元件[31]；PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A存在于水稻和大麥的α-淀粉酶基因啟動子上，是轉錄因子GARE的赤霉素響應順式調控元件，并部分參與糖抑制[32-33]。盡管在Kumar等的研究中SrUGT76G1基因的轉錄水平在GA3處理下并沒有顯著變化[24]，但是鑒于甜菊糖苷與赤霉素共用很長一段生物合成路徑，赤霉素對SrUGT76G1基因的表達調控還需深入研究。

在Kumar等的研究中發(fā)現(xiàn)甜菊糖苷主要在葉片中積累，尤其是頂部向下第三對葉，花和莖中含量次之，根中幾乎沒有，甜菊糖苷合成途徑相關基因的轉錄水平也有相似的結果，表現(xiàn)出很強的組織相關性[24]。通過對SrUGT76G1啟動子順式元件的分析，確實發(fā)現(xiàn)該序列上存在一些組織特異性表達元件，且大多是芽特異性表達相關的。由于甜菊葉片中糖苷含量在現(xiàn)蕾期達到最高，開花后逐漸下降[34-35]，我們推測一些關鍵基因受生理節(jié)律的調控。在SrUGT76G1啟動子序列中也確實發(fā)現(xiàn)有生理節(jié)律調控相關元件，如：-10PEHVPSBD、CIACADIANLELHC和EVENINGAT。

目前，植物基因工程中常用的啟動子仍以CaMV35S為主，CaMV35S是組成型啟動子，不表現(xiàn)出時間或空間的特異性。組成型啟動子驅動外源基因持續(xù)、穩(wěn)定地表達，可能會使植物消耗過多的能量和物質，而且在研究中發(fā)現(xiàn)用相同的組成型啟動子同時驅動2個或2個以上外源基因的表達可能引起基因沉默或共抑制[36]；所以克隆甜菊自身基因的啟動子，并研究其啟動子的功能對未來甜菊的分子育種具有重要參考價值。

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