陳　偉　趙桂紅　孫清江

(東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院, 南京 210096)(東南大學(xué)生物電子學(xué)國家重點(diǎn)實驗室, 南京 210096)

本文通過實驗室合成硅質(zhì)體，混合以功能化修飾的脂質(zhì)體，利用薄膜水化法將綠色油溶性量子點(diǎn)包埋在硅質(zhì)體的疏水雙層中，將紅色水溶性量子點(diǎn)包埋在硅質(zhì)體空腔內(nèi)，通過預(yù)編碼和后編碼方式調(diào)節(jié)綠色、紅色量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，制備的量子點(diǎn)/硅質(zhì)體納米載體在模擬細(xì)胞環(huán)境中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且熒光性質(zhì)穩(wěn)定.

1　材料與方法

1.1　實驗試劑及儀器

實驗中硅質(zhì)體通過多步反應(yīng)合成得到[10].二硬脂?；字Ｄ憠A(DPPC)和二硬脂酰基磷脂酰膽堿(DSPC)、磷脂聚乙二醇羧基(DSPE-PEG-COOH)分別購自Sigma Aldrich和Avanti公司.量子點(diǎn)根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]中方法制備，實驗室合成水溶性配體(DHLA-PEG-400)，對紅色量子點(diǎn)進(jìn)行改性.AR級氯仿購自南京化學(xué)試劑有限公司.實驗室配置PB緩沖液(pH=7.4)，所用的去離子水經(jīng)過Pall Cascade AN超純水系統(tǒng)處理，電阻率為18.2 MΩ.

實驗中使用的主要儀器包括：F-7000型熒光分光光度計(日本Hitachi公司)；JEM-2100型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)；Ultra Plus型掃描電子顯微鏡(德國Zeiss公司)；OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(美國EYELA公司)；ZS90型粒度電位分析儀(美國Malvern公司)；TSC-SP8型共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；CT18RT型離心機(jī)(美國Techcomp公司)；KQ-500DB型超聲波振蕩儀(中國昆山市超聲儀器有限公司).

1.2　空白硅質(zhì)體和量子點(diǎn)/硅質(zhì)體的制備

采用薄膜水化法制備空白硅質(zhì)體，取2 mg 硅質(zhì)體單體在酸性乙醇中25 ℃恒溫孵育，抽真空待用.采用適量的氯仿溶解于試管中，45 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制成均勻薄膜.薄膜抽真空過夜干燥后加入2 mL PB緩沖液，50 ℃水化20 min，超聲處理30 min 后，得到空白硅質(zhì)體懸液.

采用薄膜水化法制備量子點(diǎn)/硅質(zhì)體.步驟與空白硅質(zhì)體的制備相似，取2 mg硅質(zhì)體在酸性乙醇中25 ℃ 恒溫孵育，抽真空待用.采用一定量的氯仿溶液溶解(同時可加入綠色油溶量子點(diǎn))，45 ℃ 減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制成均勻薄膜.薄膜抽真空過夜干燥后加入2 mL PB緩沖液(同時可加入紅色水溶量子點(diǎn))，50 ℃水化 20 min，超聲處理30 min后， 在6×103和1×104r/min條件下差速離心10 min，利用PB緩沖液復(fù)溶，在1×104r/min條件下離心，沉淀得到尺寸均一的量子點(diǎn)/硅質(zhì)體懸液.功能化磷脂摻雜的量子點(diǎn)/硅質(zhì)體制備過程同上.本文研究了摻雜不同種類磷脂和不同摩爾比的硅質(zhì)體、DPPC、DSPE對結(jié)構(gòu)的影響.

1.3　預(yù)編碼量子點(diǎn)/硅質(zhì)體的制備

采用薄膜水化法制備預(yù)編碼量子點(diǎn)/硅質(zhì)體，步驟與量子點(diǎn)/硅質(zhì)體的制備相似.通過在制備過程中優(yōu)化綠色油溶量子點(diǎn)和紅色水溶量子點(diǎn)的濃度，預(yù)先設(shè)計固定發(fā)射峰為505 nm的 CdSe/ZnS綠色量子點(diǎn)的濃度為4 mg/mL.然后，改變發(fā)射峰為612 nm的CdSe/CdZnS/ZnS紅色水溶量子點(diǎn)的濃度，將其設(shè)定為1，2，4 mg/mL，制備出綠色和紅色熒光強(qiáng)度比為2∶1，1∶1，1∶2的編碼量子點(diǎn)/硅質(zhì)體納米載體.

1.4　后編碼量子點(diǎn)/硅質(zhì)體的制備

采用薄膜水化法制備后編碼量子點(diǎn)/硅質(zhì)體，步驟與量子點(diǎn)/硅質(zhì)體的制備相似.首先，按照預(yù)編碼量子點(diǎn)/硅質(zhì)體的制備原理，制備出綠色、紅色量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度比為1∶2的量子點(diǎn)/硅質(zhì)體，加入5 nmol/L 銅離子，觀測35 min內(nèi)綠色、紅色熒光強(qiáng)度比變化，得到后處理的編碼量子點(diǎn)/硅質(zhì)體.

1.5　形態(tài)學(xué)表征

利用動態(tài)光散射儀測定各種硅質(zhì)體的粒度和Zeta電位.將樣品沉積在銅網(wǎng)上，采用2%的鎢酸鹽溶液進(jìn)行負(fù)染，室溫干燥后利用透射電鏡對尺寸和量子點(diǎn)包埋情況進(jìn)行觀察.將樣品滴涂在銅片上，自然干燥后利用掃描電鏡觀察粒子形貌，采用元素分析法測定硅質(zhì)體Si的含量.

1.6　熒光性能表征

利用熒光分光光度計對量子點(diǎn)/硅質(zhì)體進(jìn)行熒光測量試驗時，選用光電倍增管電壓為400 V，狹縫寬度為5 nm，量子點(diǎn)選用的激發(fā)波長為380 nm.將樣品滴在載玻片上附加蓋玻片，倒置放入共聚焦顯微鏡，觀察量子點(diǎn)/硅質(zhì)體熒光及形貌.

1.7　穩(wěn)定性實驗

為了證明量子點(diǎn)/硅質(zhì)體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的優(yōu)越性，研究了pH值、生物交聯(lián)劑以及模擬細(xì)胞環(huán)境中離子、生物大分子條件對量子點(diǎn)/硅質(zhì)體熒光強(qiáng)度的影響.

2　實驗結(jié)果

2.1　空白硅質(zhì)體和量子點(diǎn)/硅質(zhì)體的粒徑和形態(tài)學(xué)表征

通過觀察空白硅質(zhì)體和量子點(diǎn)/硅質(zhì)體在電鏡下的形貌可以驗證納米囊泡結(jié)構(gòu)的完整性和立體性.由圖1(a)和(b)可知，均勻分布的空白硅質(zhì)體納米囊泡粒徑為80～130 nm，水合直徑為(126.3±5.3) nm.由圖1(c)和(d)可知，包覆雙色量子點(diǎn)的硅質(zhì)體仍能保持良好的球形形貌，且量子點(diǎn)清晰可見，大小均一，粒徑略有增加，在100～150 nm之間，水合直徑為(143.7±6.4) nm.

(a) 空白硅質(zhì)體TEM

(b) 空白硅質(zhì)體SEM

(c) 量子點(diǎn)/硅質(zhì)體TEM

(d) 量子點(diǎn)/硅質(zhì)體SEM

圖1空白硅質(zhì)體和量子點(diǎn)/硅質(zhì)體的形態(tài)學(xué)表征

2.2　功能化磷脂摻雜對硅質(zhì)體結(jié)構(gòu)的影響

為了提高量子點(diǎn)/硅質(zhì)體的生物相容性和表面功能化，首先摻雜了20%的DSPC，其電鏡結(jié)果見圖2(a).由圖可知，部分納米球形結(jié)構(gòu)破裂，分析原因在于相變溫度較低，成球過程中脂質(zhì)體不能與硅質(zhì)體融合均勻，造成塌陷破損.

然后，利用電鏡下觀察摻雜DPPC和DSPE含羧基官能團(tuán)(摻雜百分?jǐn)?shù)分別為42.5%和20%)的樣本，結(jié)果見圖2(b).由圖可知，球形結(jié)構(gòu)完整并能觀察到雙分子層結(jié)構(gòu)，尺寸均一，粒徑與空白硅質(zhì)體相似，為80～130 nm.

提高含羧基官能團(tuán)DSPE磷脂的摻雜百分?jǐn)?shù)，可以提高該納米載體的表面功能化效率(見表1).當(dāng)硅質(zhì)體與DPPC的摩爾比為1∶1時，分別摻雜25%和30%的DSPE，包覆雙色量子點(diǎn)后的透射電鏡結(jié)果見圖2(c)和(d).摻雜30%DSPE的量子點(diǎn)/硅質(zhì)體球型結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，存在擠壓變形，摻雜25%DSPE的量子點(diǎn)/硅質(zhì)體球型結(jié)構(gòu)飽滿，大小均一，粒徑為100～150 nm.

(a) 摻雜20% DSPC

(b) 摻雜20% DSPE

(c) 摻雜25% DSPE

(d) 摻雜30% DSPE

圖2摻雜功能化磷脂的量子點(diǎn)/硅質(zhì)體的TEM照片

表1摻雜功能化磷脂的硅質(zhì)體的Zeta值

ρ/%n純水PBS201∶1∶1．5-42．7±0．7-8．9±0．4251∶1∶2．0-41．6±0．9-7．4±0．3301∶1∶2．5-39．5±0．7-5．9±0．5注：ρ為DSPE的摻雜百分?jǐn)?shù)；n為硅質(zhì)體、DPPC和DSPE的摩爾比．

2.3　預(yù)編碼量子點(diǎn)納米載體

利用摻雜25%DSPE磷脂的硅質(zhì)體進(jìn)行量子點(diǎn)編碼.圖3給出了預(yù)編碼方式制得的3種熒光比例量子點(diǎn)/硅質(zhì)體納米載體的熒光光譜圖.通過調(diào)節(jié)2種顏色量子點(diǎn)的濃度，可實現(xiàn)量子點(diǎn)/硅質(zhì)體的綠色與紅色熒光強(qiáng)度比分別為2∶1，1∶1，1∶2.通過熒光共聚焦顯微鏡觀察，對應(yīng)量子點(diǎn)/硅質(zhì)體分別顯示出綠色、黃色和紅色熒光.

2.4　后編碼量子點(diǎn)納米載體

利用后編碼方式實現(xiàn)對量子點(diǎn)/硅質(zhì)體的熒光編碼.由圖4中的熒光光譜變化可知，在預(yù)編碼方式制備的綠色與紅色熒光強(qiáng)度比為1∶2的量子點(diǎn)/硅質(zhì)體懸液中加入5 nmol/L Cu2+，10 min時熒光強(qiáng)度比變?yōu)?∶1，30 min時熒光強(qiáng)度比變?yōu)?∶1，且熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定.隨著Cu2+濃度的提高，其淬滅效率也逐步增強(qiáng).

2.5　穩(wěn)定性實驗

將預(yù)編碼方式制備的綠色和紅色熒光強(qiáng)度比為1∶1的量子點(diǎn)/硅質(zhì)體作為穩(wěn)定性實驗樣本.如圖5(a)所示，在24 h內(nèi)，pH=5～9的條件下，其熒光強(qiáng)度基本不變.在常用生物交聯(lián)劑(如可溶于水的碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、親和素(AV)和鏈霉親和素(SA)等)存在的條件下，量子點(diǎn)/硅質(zhì)體仍能保持良好的熒光穩(wěn)定性(見圖5(b)).在模擬細(xì)胞環(huán)境中，各種離子強(qiáng)度和生物大分子對量子點(diǎn)的熒光影響見圖5(c).由圖可知，除了部分重金屬離子(如Cu2+)的微弱影響外，熒光強(qiáng)度比基本穩(wěn)定，說明包覆硅質(zhì)體可以提高量子點(diǎn)對環(huán)境的抗干擾能力.

(a) 2∶1編碼

(b) 1∶1編碼

(c) 1∶2編碼

圖4　后編碼量子點(diǎn)/硅質(zhì)體的熒光性能

(a) pH穩(wěn)定性

(b) 生物交聯(lián)劑穩(wěn)定性

(c) 模擬細(xì)胞環(huán)境的穩(wěn)定性

3　結(jié)果分析

硅質(zhì)體具有獨(dú)特的雙分子層結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，是一種由一層或多層類磷脂分子自組裝而成的囊泡.在水溶液中，硅質(zhì)體單體自然排列成一個密閉的球形，疏水端在膜內(nèi)側(cè)，親水端在膜的兩側(cè)，可以實現(xiàn)對不同性質(zhì)納米材料的包覆.量子點(diǎn)比率熒光技術(shù)[13]是以2種熒光強(qiáng)度比作為輸出信號的檢測技術(shù)，具有內(nèi)部矯正信號、提高檢測限等優(yōu)點(diǎn).因此，將2種不同性質(zhì)、不同顏色的量子點(diǎn)分別包覆在硅質(zhì)體膜內(nèi)與腔內(nèi)，可構(gòu)建出比率熒光檢測平臺.

多元檢測是生物醫(yī)學(xué)分析中的重要方法.實驗中通過調(diào)節(jié)2種不同顏色量子點(diǎn)在硅質(zhì)體內(nèi)的熒光強(qiáng)度比，構(gòu)建多種顏色編碼，為多元檢測提供編碼納米載體[14].利用傳統(tǒng)的預(yù)編碼方式，通過固定綠色油溶量子點(diǎn)的濃度，改變紅色水溶量子點(diǎn)的濃度，制備出綠色和紅色熒光強(qiáng)度比為2∶1，1∶1，1∶2的不同編碼的量子點(diǎn)/硅質(zhì)體納米載體.

量子點(diǎn)表面配體的電荷或組成成分變化會影響核內(nèi)電子-空穴的再復(fù)合，從而影響量子點(diǎn)的發(fā)光效率和熒光強(qiáng)度.基于能量轉(zhuǎn)移和電荷轉(zhuǎn)移等機(jī)制，某些重金屬離子(如Cu2+)在靠近量子點(diǎn)時會導(dǎo)致量子點(diǎn)熒光淬滅[15].根據(jù)這一原理，本文提出了一種后編碼的方式[16]，通過在預(yù)編碼方式制備的綠色與紅色熒光強(qiáng)度比為1∶2的量子點(diǎn)/硅質(zhì)體中調(diào)控加入Cu2+的濃度，降低紅色量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度，改變綠色與紅色量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度比，從而實現(xiàn)對量子點(diǎn)/硅質(zhì)體的編碼.

4　結(jié)論

1) 利用薄膜分散超聲法制備摻雜25%DSPE的量子點(diǎn)/硅質(zhì)體納米熒光載體，粒徑約100～150 nm.通過硅質(zhì)體對量子點(diǎn)的包覆，使雙色量子點(diǎn)在保持優(yōu)異光學(xué)性能的同時也提高了抗環(huán)境干擾能力，有利于將量子點(diǎn)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域.

2) 利用預(yù)編碼和后編碼方式靈活準(zhǔn)確地對量子點(diǎn)/硅質(zhì)體進(jìn)行編碼，為后續(xù)多元檢測奠定基礎(chǔ).摻雜帶有功能化基團(tuán)的磷脂DSPE-PEG-COOH，可以在其表面進(jìn)行納米組裝并構(gòu)建多功能量子點(diǎn)熒光傳感器，在細(xì)胞成像方面具有廣闊的發(fā)展前景.

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