呂遠(yuǎn)蓉 王懷禹 魏 玲 南充職業(yè)技術(shù)學(xué)院 637000

兔病毒性出血癥 （Rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一種急性、烈性傳染病，該病傳播快、病死率高，可給兔場造成災(zāi)難性打擊，是目前危害養(yǎng)兔業(yè)的主要疫病之一[1]。蜂膠是由蜜蜂采集的植物樹脂與其自身的消化腺等的分泌物混合而形成的一種膠黏性固體物，具有殺菌、抗病毒、抗腫瘤、促進(jìn)組織再生、抑制過氧化物生成等廣泛的藥理活性及保健功能，將其作為疫苗佐劑既能增強(qiáng)體液免疫能力，又可促進(jìn)細(xì)胞免疫能力，可有效提高疫苗的免疫效果[2]。本研究將蜂膠作為疫苗佐劑，制備了RHDV滅活疫苗，并分析了其免疫效果，以期為RHD新型疫苗的研制開發(fā)和推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

（1）毒株、試驗(yàn)動物、蜂膠。兔病毒性出血癥病毒（組織毒）由南充職業(yè)技術(shù)學(xué)院種畜場實(shí)驗(yàn)室分離并保存；2月齡健康新西蘭白兔購自黎明種兔場；蜂膠購自山東綠都安特動物藥業(yè)有限公司。

（2）活抗原的制備與檢驗(yàn)。將RHDV與10倍體積滅菌生理鹽水搗碎后，頸部皮下注射易感兔，1mL/只，無菌采集接種后24～96小時內(nèi)死亡兔的肝臟，將其與5倍體積滅菌生理鹽水充分搗碎，-70℃下保存。將制備的RHDV抗原用滅菌生理鹽水依次進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 和 10-6 10 倍倍比稀釋， 取各稀釋度頸部皮下注射易感兔5只，根據(jù)Reed-Muench法計算抗原對家兔的半數(shù)致死量（LD50）。

（3）滅活抗原的制備與檢驗(yàn)。取制備的RHDV抗原2000mL，加入甲醛溶液8mL，即甲醛終濃度為0.4%，密封后，37℃下作用48小時，4℃下保存。效價測定。測定滅活抗原對人“O”型紅細(xì)胞的凝集效價。無菌檢驗(yàn)。按《中華人民共和國獸藥典》三部二○一五年版附錄3306進(jìn)行，應(yīng)無菌生長。滅活檢驗(yàn)。取滅活抗原皮下注射易感兔5只，4mL/只，觀察10天，應(yīng)全部健活。

（4）蜂膠滅活疫苗的制備與檢驗(yàn)。將蜂膠碾碎后與10倍體積無水乙醇混合，攪拌溶解后靜置，上層澄清透明的栗色溶液即為蜂膠乙醇提取液。將RHDV滅活抗原與蜂膠乙醇提取液等體積混合，高速乳化，無菌分裝，20mL/瓶，4℃下保存。物理性狀檢驗(yàn)，應(yīng)為黃褐色均勻混懸液，靜置后底部有少量沉淀。無菌檢驗(yàn)，按《中華人民共和國獸藥典》三部二0一五年版附錄3306進(jìn)行，應(yīng)無菌生長。安全檢驗(yàn)，取滅活疫苗皮下注射易感兔4只，4mL/只，觀察10天，應(yīng)全部健活。

（5）疫苗最適免疫劑量的確定。給20只易感兔分別注射疫苗0mL、0.25mL、0.5mL和1.0mL，免疫后14天，各組兔皮下注射1000 LD50的RHDV活抗原，觀察7天。

（6）疫苗免疫保護(hù)期的確定。取滅活疫苗皮下注射易感兔 40 只，0.5mL/只， 分別在免疫后 3、5、7、14、30、60、120和 180天隨機(jī)取 5只兔皮下注射 1000 LD50的RHDV活抗原，根據(jù)攻毒兔的死亡情況判斷疫苗的免疫保護(hù)期。

（7）疫苗保存期的確定。將疫苗在4℃下分別保存3、6、9、12和18個月后， 分別注射易感兔 5只，0.5mL/只免疫后14天，各組兔皮下注射1000 LD50的RHDV活抗原，根據(jù)攻毒兔的死亡情況判斷疫苗的保存期。

2 結(jié)果與分析

（1）活抗原的檢驗(yàn)。根據(jù)Reed-Muench法測定活抗原對家兔的LD50為10-5.17/mL。

（2）滅活抗原的檢驗(yàn)。滅活抗原對人“O”型紅細(xì)胞的凝集效價為1∶1024，無菌檢驗(yàn)合格，滅活檢驗(yàn)合格。

（3）滅活疫苗的檢驗(yàn)。物理性狀檢驗(yàn)合格，無菌檢驗(yàn)合格，安全檢驗(yàn)合格。

（4）最適免疫劑量的確定。如表1所示，疫苗免疫0.25mL可提供80%的保護(hù)率，免疫0.5mL可提供100%的保護(hù)率，確定疫苗的最適免疫劑量為0.5mL。

（5）疫苗免疫保護(hù)期的確定。疫苗免疫后3天可提供40%的保護(hù)率，免疫后5天可提供80%的保護(hù)率，免疫后7天可提供100%的保護(hù)率，至疫苗免疫后180天仍可提供100%的保護(hù)率。

（6）疫苗保存期的確定。如表3所示，疫苗在4℃下保存18個月后，保護(hù)率仍為100%。

3 討論

隨著我國綠色、環(huán)保、健康養(yǎng)殖理念的普及，安全環(huán)保、抗體產(chǎn)生快、免疫保護(hù)期長等指標(biāo)逐步成為新型動物疫苗的研究方向。本研究以自行分離的RHDV毒株為疫苗毒種，以蜂膠作為疫苗佐劑，成功制成RHD蜂膠滅活疫苗。試驗(yàn)結(jié)果表明，該疫苗對家兔的刺激小，無不良反應(yīng)，具有良好的安全性。疫苗以0.5mL/只的劑量免疫后7天即可提供100%的保護(hù)率，且至疫苗免疫后180天仍可提供100%的保護(hù)率，具有抗體產(chǎn)生快，持續(xù)期長等優(yōu)點(diǎn)。分析該疫苗抗體起效快、免疫期持久的原因，可能為蜂膠顆粒與裸露游離的病毒粒子相互交聯(lián)形成類免疫刺激復(fù)合物的特殊結(jié)構(gòu)，接種于機(jī)體后該特殊結(jié)構(gòu)可迅速刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，并具有抗原“倉庫”作用，刺激機(jī)體一直產(chǎn)生高水平的免疫抗體?？傊?，以蜂膠作為佐劑的RHDV滅活疫苗抗體產(chǎn)生快、免疫保護(hù)期長、疫苗保存期長，是一種值得推廣的新型RHD疫苗。

參考文獻(xiàn):

[1]李岳余，張立穎.兔病毒性出血癥的防治[J].中國動物保健，2016，18（3）：27-28.

[2]王凱，何天駿，胡福良.蜂膠佐劑在獸用疫苗中的應(yīng)用[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（10）：111-115.